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细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的重要载体，细胞外囊泡的研究具有重要的基础和临床意义。这一点被越来越多的研究者所认可。这些年随着囊泡领域的突飞猛进，多种不同分离原理的分离策略也逐渐进入研究者的视野，对应的商业化试剂盒也开始进入实验室甚至逐渐走向临床。但是由于技术限制，目前不同分离策略富集到的细胞外囊泡纯度依旧还没有很好的评估方法。 最近，厦门大学颜晓梅教授团队在细胞外囊泡领域专业顶级刊物Journal of Extracellular Vesicles（影响因子11）上发表文章，报道了基于纳米流式细胞仪的分析策略，对常见的6中细胞外囊泡分离策略进行囊泡纯度和富集效率的评估。并证实超速离心分离是分离纯度最好的细胞外囊泡分离方法。
由于体液和细胞培养基中存在大量干扰非囊泡成分，例如蛋白质，细胞碎片和其他颗粒，因此，细胞外囊泡的高纯度分离是进行蛋白质组学，基因组和脂质组学分析的基础研究和生物标记物发现的先决条件。不幸的是，由于其纳米级的尺寸和大量的异质性，从生物体液中有效地和选择性地分离高纯度细胞外囊泡仍然是一项重大挑战。国际细胞外囊泡协会强调了在细胞外囊泡富集和质量评估中迫切需要标准化的方法。 差速超速离心（UC）一直是细胞外囊泡分离的经典方法，但它耗时，劳动强度大且操作技术要求高。为了解决常规EV提取中的障碍，基于不同原理的众多分离技术已应用于从生物体液和细胞培养上清EV纯化中，例如基于聚合物的沉淀，尺寸排阻色谱法（SEC），超滤（UF），流场-流分离，免疫亲和捕获，基于微流控芯片的技术以及这些技术的组合应用等。近来，很多公司提供了许多商业化的外泌体分离试剂盒，并且已经在细胞外囊泡相关的文献中广泛应用。例如，依赖于聚合物沉淀的ExoQuick（System Biosciences）和Total Exosome Isolation试剂盒（TEI，Invitrogen）。 基于SEC的qEV（Izon）分离柱；离心过滤装置制作的超滤试剂盒（UF，密理博）；和exoEasy（Qiagen）建立在基于膜的亲和力结合上的富集策略等。尽管这些工具耗时少，在少量生物体液进行囊泡分离时更易实现，并且不需要特殊设备，但由于EV制剂的质量不确定，它们在科学和临床应用中的适用性值得怀疑。对于血浆或血清样品，尤其如此！因为细胞外囊泡和脂蛋白之间在粒径和密度上存在相当大的重叠，这通常会导致这两个不同颗粒的共分离。 过去的几项研究试图比较从血液样本中分离EV的各种技术的分离效率。但这些通常是描述性的数据，缺少必要的实验验证。纯度评估时多采用整体平均值的方式衡量纯度（例如WB、粒子数目等），无法避免与囊泡物理性质接近的颗粒（如脂蛋白颗粒）对结果的影响。同时，所采用的设备也不足以揭示所有尺寸的EV的全貌。 颜晓梅教授团队在这篇文章中，利用流式细胞仪实现了与电子显微镜相当的分辨率和流式细胞仪的表型分析能力，评估了通过不同方法进行的细胞外囊泡分离的质量和效率。测量了诸如尺寸分布，颗粒浓度，纯度，回收率和表面蛋白的性质等指标。以人血浆为模型系统，并将几种商业分离试剂盒的性能与经典差分UC方法进行了比较。 该研究利用5中广泛使用的商业化试剂盒从血浆（最难纯化外泌体的体液类型之一）中分离出细胞外囊泡，并且将其分离囊泡的质量和效率与传统的差异超速离心（UC）进行了比较。与通过UC制备的EV制剂相比，通过试剂盒从无血小板血浆（PFP）制备的EV制剂观察到的颗粒浓度高出2至4个数量级，但纯度却低得多。同时，通过试剂盒制备的EV制剂的粒度分布曲线与PFP的粒度分布图非常相似，而通过UC制备的EV制剂在相对较大的粒度下显示出较宽的粒度分布。当使用这些试剂盒从去除细胞外囊泡的无血小板血浆（VD-PFP）中分离“细胞外囊泡”时，得到的样品颗粒数目与从无血小板血浆（PFP）中分离的囊泡制剂颗粒数相似，这再次证实了大量非泡囊污染物的存在。 不同分离策略得到血浆细胞外囊泡的纯度和效率对比： 该研究的结论建立在囊泡剔除以及囊泡破坏性检测试验上，巧妙的设计实验，避开了诸如游离的CD63等蛋白分子、非囊泡性脂蛋白颗粒等多种血浆中常见分子和颗粒物对评价结果的影响。文章的结论严谨，论证清晰。相信这一研究结果将为细胞外囊泡质量分析的标准化策略提供重要的数据支撑。 不同分离得到非细胞外囊泡颗粒的比例对比：
不同分离得到非细胞外囊泡颗粒的比例对比：
外泌体之家主编 点评：
颜晓梅教授团队利用自己实验室开发的纳米流式细胞仪对目前常见的细胞外囊泡分离方法的分离质量和效率进行了评估。利用流式细胞仪进行TritonX-100破膜前后的粒子数目对比，去除囊泡和未去除囊泡血清中纯化颗粒物数目对比，抗体染色检测CD63等经典囊泡标志物阳性囊泡颗粒在囊泡样品颗粒中的比例等多种严谨的策略实现了对不同分离策略分离血浆细胞外囊泡质量和效率的评估。 评估结果可能让一些朋友感到以外：超速离心表现出了极好的质量，分离囊泡的纯度明显超越其他方法。但是细细想来，这一结果也是意料之中的。血浆是目前细胞外囊泡分离纯化中最难处理的复杂体液样本之一。血浆中包涵大量的脂蛋白颗粒，其中乳糜颗粒和极低密度脂蛋白的粒子直径与细胞外囊泡（尤其是外泌体）有近乎完美的重合，目前的研究表明，脂蛋白颗粒在血浆中的数量是细胞外囊泡数量的近万倍，因此基于尺寸排阻的策略很难去除这些颗粒物。同样，其他分离策略也很难避免这些颗粒的影响。在血浆细胞外囊泡的分离中，基于沉降系数的超速离心自然可以基于微小的沉降系数差异，将脂蛋白颗粒与囊泡区分开，自然也就成了纯度最好的分离策略。当然，超速离心也有待进一步优化，如何提升超速离心的分离效率是目前值得探讨和研究的。 这一研究也存在小的缺陷。例如，在未考虑尺寸仅有十几纳米的高密度脂蛋白颗粒，高密度脂蛋白颗粒在总脂蛋白颗粒中占比不大，但同样会影响细胞外囊泡样品的纯度。不过，瑕不掩瑜，这篇文章对细胞外囊泡领域的贡献是毋庸置疑的！
值得一提的是，这些分离方法其实各有优略，大家还是要根据自己的需求来选择合适的分离方法。
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|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2019-12-29 12:12:12
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发表于 2019-12-31 17:14:52
