Circulation：人iPSC及其分化的心脏细胞的外泌体miRNAs图谱
近日，来自斯坦福大学的Joseph C. Wu教授等在Circulation杂志（影响因子23.603）上发表Research Letter文章，报道了人诱导多能干细胞（iPSC）及其分化的心脏细胞（心肌细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞）分泌的外泌体miRNAs图谱，不同细胞分泌的外泌体miRNA组成有相同更有不同，并提出iPSC外泌体特异性miRNA可用于检测iPSC分化细胞中iPSC的污染程度。  心脏来源的外泌体因其在旁分泌通讯和再生疗法中的作用而受到广泛关注。但是，目前对外泌体如何介导细胞信号传导的理解尚不完全，部分原因是来自不同心脏细胞类型的外泌体的成分定义不明确。为了了解心脏细胞释放了什么信号，该研究检查了人类诱导多能干细胞（iPSC）和3种主要的iPSC来源的心脏细胞类型分泌的外泌体中microRNA（miRNA）的组成。 经过斯坦福大学机构审查委员会的批准并获得知情同意，来自2位健康供体的人iPSC系在斯坦福心血管研究所生物库中重新编程，并使用已建立的方案分化为心肌细胞（iPSC-CMs、内皮细胞（iPSC-ECs）和心脏成纤维细胞（ iPSCCFs）。低产量一直是阐明细胞外囊泡的组成和功能的瓶颈。为了提高分离效率，该研究使用了一种机械分选设备（ExoTIC），可以从少量培养基中分离出外泌体。该设备是一种工程流体系统，可通过纳米多孔膜输送培养基，以选择性地捕获直径为50-200 nm的囊泡。使用纳米粒子跟踪分析和免疫印迹验证了提取的外泌体，并确认了优于传统沉淀方法的优异产量（图A）。然后，从2个生物学重复的外泌体中分离出总RNA（≥18 nt），用于在IlluminaNextSeq平台上进行文库生成和小RNA测序。在适配器剪接后，将测序读段映射到GRCh38人类参考基因组，并使用常规管道针对miRBase v.22.1坐标进行注释。 从94种miRNA基因中鉴定出了120种miRNA（成熟或茎环），这些基因在分析的细胞类型中被分泌（两系中的标准化读取计数均≥10）。外泌体的miRNA分布显示：（1）被Lin28抑制的let-7 miRNA前体如预期般在iPSC分泌组中不存在；（2）仅分泌全部细胞miRNA的一个子集（例如，miR-155和miR-143都被发现优先存在于iPSC胞内，而非外泌体中）；（3）所有3种心脏细胞类型都分泌共同的miRNAs组分（例如miR-320）；（4）重要的是，每种外泌体类型中有不同成熟miRNA的明显富集或耗竭（图B）。例如，对心脏发育和病理至关重要的miR-1仅在iPSC-CM分泌的外泌体中。接下来，使用已发表的人类miRNA图谱，比较了17个不同组织中miR-1的总组织表达，这表明miR-1对横纹肌具有特异性（图C）。类似地，已知对多能干细胞具有特异性的miR-302c在iPSC衍生的囊泡中含量丰富，并且似乎也富含于骨中，可能反映了骨髓造血干细胞。最后，miR-155主要分泌于iPSC-CFs中，并在miRNA图谱中在体内分散表达。 iPSC及其分化的心脏细胞类型分泌的独特外泌体miRNAs分析 综上所述，这些数据表明，外泌体miRNA反映了其细胞类型的生物学特性，但也与细胞内总miRNA库不同。此外，还发现了一些在心血管系统中仍不清楚作用的分泌型心脏miRNA，包括miR-423和miR-125a，表明它们可能在细胞间通讯中起作用。为了促进数据共享，创建了一个交互式Web应用程序，使用户能够进行探索性分析并下载实验中发现的所有外泌体miRNA的相对丰度，可从https://bit.ly/heartsecretome免费访问，测序数据在GEO（GSE149290）上。 为了探索该分泌组图的实用性，检测到的miRNA是否随细胞计数定量缩放？如果可以，是否可以将其用于评估异种细胞混合物的组成。为了测试这一点，将iPSC-CM中（总共106个细胞）混入未分化的iPSC（102-105）培养48小时提取外泌体。用流式细胞仪验证细胞平板后，发现miR-302a和miR-302d分泌到培养基中的数量和比例随iPSC≥2个数量级的减少而减少，检测限为10至100个细胞（图D）。因为共培养物中的总细胞数是可比较的，所以显示了非iPSC富集的miRNA（miR-16）相对iPSC的比例仍然是不变的。接下来，得出组成性表达的miRNA与iPSC富含的miRNA（例如，miR-16/miR-302a或miR-302d）之间的比率量，并表明这种无单位的测量与iPSC的比例在评估的动态范围内成反比（图E）。因此，研究建议该外泌体miRNA比值可以为分化后的iPSC污染提供一种新的、简便的、非破坏性的读数，这对于再生医学，疾病建模和药物筛选很有用。 总之，该研究提出了来自人类iPSC和3种分化的心脏细胞类型的外泌体miRNA图谱。发现每种细胞类型都有不同的分泌特征，支持对分离的外泌体进行直接分析的重要性。该资源可能有助于了解外泌体生物学，并提出了监测心脏细胞制剂纯度的潜在方法。 参考文献：ChandyM, Rhee JW, Ozen MO, Williams DR, Pepic L, Liu C, Zhang H, Malisa J, Lau E,Demirci U, Wu JC. Atlas of Exosomal microRNAs Secreted From Human iPSC-Derived Cardiac Cell Types. Circulation. 2020 Nov3;142(18):1794-1796. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.048364. Epub 2020 Nov 2.PMID: 33136510.附件已隐藏，回复该贴可查看附件
| 
/1 
|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2020-11-8 13:02:35
收藏
发表于 2020-11-14 21:37:27
