EVs分离纯化后怎么保存？快参考这篇文献！

Johnny

EVs分离纯化后怎么保存？快参考这篇文献！

细胞外囊泡（EVs）涉及广泛的生理和病理过程，在过去的几十年中进行了广泛的研究。自1990年代末和2000年代初开始迅速开展与EVs相关的研究以来，为开发EVs的分离、表征、处理等方面的适当和标准化方法做出了许多努力。尽管在这一领域取得了长足的进步，EVs的一些重要方面仍未得到很好的理解。一种情况是在高于0°C的温度（即不冻结）下存储或处理EVs溶液。
关于将EVs长期存放几天至几个月的适当条件的共识是冷冻在-80°C或更低的温度下。从几个小时到几天的短期存储通常是在放置于+ 4°C的温度下，有些论文报告说是这样做的。这些存储条件在实验室实践中很常见，这很可能是由于EVs具有极高的稳定性的普遍观点以及在反复冷冻/融化循环期间EVs性能下降。除了储存外，许多实验步骤还要求将含EV的溶液在+4°C下孵育几个小时，例如，EV与beads的特异性结合、细胞对EV的吸收等。

有几项研究专门针对EVs在+4°C或室温下的稳定性进行了研究。可以在研究论文中找到更多信息，在这些论文中，按照通用主题对EVs的稳定性进行了检查。之前的研究结论具有高度异质性，因为它既包含定量结果又包含半定量结果，以及定性观察结果，这些观察结果具有不同的EV参数作为稳定性指标。同样，这些数据可能会产生偏差，因为用不稳定的EVs获得的结果不太可能被公布。但是，可以根据这些数据提出以下模式。（1）EVs在复杂的液体中（血液或血清、尿液、唾液）较为稳定，可在+4°C、甚至某些情况下+25°C储存。（2）纯化的EVs在+4°C下储存时可能不稳定，会出现颗粒浓度降低、特定标记物水平降低、粒度分布（particlesize distribution，PSD）改变。

各种protocols中的建议也有所不同。在分离EVs之前，预先处理的卵巢卵泡液可能会在+4°C下保存长达一周。纯化后的EVs在+ 4°C下最多可存储48-72小时，同时建议将分离的EVs在冰上保存并按以下步骤尽快处理。这种模棱两可表明需要仔细研究+4°C下的EV不稳定现象。

有几个不同的过程可能是纯化的EVs在+4°C下随时间推移而逐渐降解的原因（如下图）：

文献中提出的在+4˚C储存期间EVs损失/降解的假想过程

• EV的蛋白质或其他标记分子发生降解，但囊泡的完整性或计数没有变化。该假设与声称颗粒浓度降低和PSD变化的报道相矛盾。另一方面，该过程可能伴随其他降解途径。
• 囊泡分解成较小的碎片，同时其内容物泄漏到周围的溶液中。在+ 4°C下长期存放EV期间，平均粒径的减小可为该过程提供支持。
• 囊泡的聚集或融合。很难区分这两个过程，但是它们都减少了颗粒数并增加了平均粒径。
• 囊泡吸附在管壁上。在同行评审的论文中，没有针对EVs的直接实验证据的报道，但多名研究人员警告说，这一过程可能在储存过程中发生。一些研究和方案报道了将低蛋白结合管用于EVs的存储或处理，但没有实验依据。
  

如果初始EVs的浓度不同，存储中也表现出不同的行为。标记分子降解而颗粒数量不变的过程与颗粒浓度无关。其余三个机制导致浓度随时间降低。囊泡分解成较小碎片时的相对损失应与初始浓度无关，因为每个囊泡都会自行分解。另一方面，聚集/融合的早期是两个颗粒之间的过程，因此任何给定时间的相对损耗都应随着初始浓度的增加而增加。EVs在试管表面的吸附行为不同。如果浓度很高并且物质的总量远大于表面结合能力，则几乎不会发生相对损失。如果浓度足够低，那么与表面结合能力相比，物质的总量就很低，溶液中的所有物质最终都会丢失。

因此，该研究旨在调查EVs溶液在+4°C下短期存储期间发生的变化，以进一步了解EV损失的潜在机制。

HT-29条件培养基中分离的囊泡的表征

在+4°C下短期保存细胞外囊泡（EVs）溶液是一种常见的做法，但是尚不完全了解此过程中EVs的稳定性。使用纳米粒子跟踪分析发现，从HT-29细胞的条件培养基中分离出的EVs在PBS中储存在普通聚丙烯管中的浓度在（0.5–2.1）×10[size=0.625em]10粒子/mL范围内时，浓度会明显降低。在+4°C下储存48小时，在2毫升Eppendorf管中，0.5毫升EV的EV损失达到51±3％。观察到的损失的约2/3归因于囊泡吸附到管壁上。该结果表明，在纯EVs的浓度低于2×10[size=0.625em]10颗粒/ mL时在+ 4°C条件下容易发生吸附损失。通过使用Eppendorf Protein LoBind管或表面被牛血清白蛋白或EV封闭的普通管，在48小时内总颗粒损失可降低至18-21％。作为条件培养基的模型，在100 000 g离心后，溶解在上清液中的分离的EV损失降低到15％。另外，对于EVs，其扩散控制吸附的一个以前未知的特征被揭示。除了减少颗粒数量外，此过程还会导致较小颗粒的大量损失。

在+4°C下将分离的EVs储存在PBS（0.5 ml）中，颗粒浓度和平均大小的变化

测得的吸附动力学与数值模拟的比较

在+4˚C下储存48 h，不同类型/处理的试管中的EVs总浓度损失的比较

参考文献：Evtushenko EG, Bagrov DV, Lazarev VN, Livshits MA,Khomyakova E. Adsorption of extracellular vesicles onto the tube walls duringstorage in solution. PLoS One. 2020 Dec 28;15(12):e0243738. PMID: 33370319.
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