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外泌体的分离鉴定

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发表于 2017-6-2 20:54:45 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
本帖最后由 jinzc0228 于 2017-6-2 20:54 编辑

上周用分别用SBI的EXOquick-TC试剂盒和超速离心法提取了细胞培养上清的外泌体,都可见明显的有形沉淀,均用200μl重悬后冻存在-80度。
然后做了DLS分析,粒径在除了在100NM附近分布以外,也有很多大粒径颗粒存在。
问题来了:1.两种方法提取分离过程中均用0.22微米滤膜过滤,为什么最后都有大粒径的颗粒存在?是否外泌体没有分散好?
               2.用基于适配体和抗体捕获的多种方案检测外泌体,均无明显信号,是否可能外泌体在从-80度拿出后在室温下复溶时,外泌体都破坏掉了






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发表于 2017-6-3 01:14:18 | 只看该作者
Kit没有用过,不发表意见。但超速离心后确实看见过大的particle (>200 nm),有文献说超速离心会导致aggregates的形成。

我们实验室免疫亲和捕捉的方法,CD63抗体,人血清。WB检测到elute中很强的CD63信号。你用的抗体是否适用于IP?细胞培养基上清中exosome浓度是多少?这些因素都会影响抗体-抗原识别。

祝实验顺利。
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 楼主| 发表于 2017-6-3 07:17:15 来自手机 | 只看该作者
外泌体浓度没测,打算捕获实验有结果后再做定量,因为看到了有形沉淀,猜想浓度应该不低。外泌体来自于HepG2细胞,捕获用的适配体和抗体分别采用了cd63和epcam,均无明显信号,还没用WB验证
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发表于 2017-6-3 16:27:30 | 只看该作者
jinzc0228 发表于 2017-6-3 07:17
外泌体浓度没测,打算捕获实验有结果后再做定量,因为看到了有形沉淀,猜想浓度应该不低。外泌体来自于HepG ...

你用cd63能看到沉淀吗?用了多少毫升培养基?
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 楼主| 发表于 2017-6-3 21:36:51 | 只看该作者
meiling 发表于 2017-6-3 16:27
你用cd63能看到沉淀吗?用了多少毫升培养基?

cd63抗体只是在分离外泌体后做捕获探针来验证外泌体的存在,SBI 试剂提取用了30ML,超离用了100ML培养基上清
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发表于 2017-6-7 09:14:09 | 只看该作者
同问,我在超高速离心的时候也出现了第一种情况
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发表于 2017-6-19 10:51:20 | 只看该作者
问一下楼主关于CD63适配体识别,你是用的荧光竞争的吗?
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发表于 2017-6-19 20:50:58 | 只看该作者
baishixiaoyaozi 发表于 2017-6-3 01:14
Kit没有用过,不发表意见。但超速离心后确实看见过大的particle (>200 nm),有文献说超速离心会导致aggrega ...

请问您有免疫亲和捕捉的protocol吗,老板让做,可我在这方面不太懂
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发表于 2017-6-23 00:51:02 | 只看该作者
八戒在五湖 发表于 2017-6-19 20:50
请问您有免疫亲和捕捉的protocol吗,老板让做,可我在这方面不太懂

https://scholar.google.com/schol ... =&as_sdt=1%2C21
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