中科院微系统所：多色荧光数字PCR对囊泡lncRNA的定量分析

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中科院上海微系统所：基于多色荧光数字PCR技术对肺癌患者外周血中细胞外囊泡lncRNA的绝对定量和分析

肺癌相关的细胞外囊泡（EV）中的lncRNA是临床上有价值的生物标志物，可用于液体活检早期诊断。然而，外周血中极微量的EV-lncRNA是多靶点检测的主要挑战。来自中国科学院上海微系统与信息技术研究所毛红菊课题组以及同济大学附属上海肺科医院陈昶课题组的研究人员开发了一种新的多色荧光数字PCR EV-lncRNA（miDER）分析芯片，能够快速准确地分析外周血中微量的肺癌EV-lncRNA生物标记物。该研究发表于Biosensors and Bioelectronics杂志上（影响因子9.518）。

肺癌是世界上发病率最高、最常见、死亡人数最多的恶性肿瘤。由于肺组织的复杂性，早期肺癌没有明显的症状，并且肺癌易于扩散和转移，通常在诊断时已经是中期或晚期。肺癌的早期检测主要基于成像和肿瘤蛋白标记物检测。先进的成像技术，如多层螺旋计算机断层扫描（CT）和正电子发射断层扫描（PET）可以检测直径约2-6毫米的肿瘤。低剂量螺旋CT具有高灵敏度，使患者避免了一些其他创伤性检查。然而，由于低剂量螺旋CT灵敏度高、误报率高，导致目前低剂量螺旋CT的过度诊断、误报和不必要的活检。因此，通过低剂量CT筛查后鉴别真阳性和假阳性是一个迫切的问题。

肺组织活检可提供高诊断准确性。然而，这种方法不方便且具有侵入性并且可能导致额外的并发症。因此，迫切需要非侵入性和高敏感度的诊断方法来改善早期诊断和结果。体液如血液被认为是疾病诊断的理想样本。先前的研究已经表明，从血液中收集包括外泌体和微泡在内的细胞外囊泡（EV）用于进一步分析，是肿瘤衍生物和生物标记物的新来源。

EV是由大多数细胞分泌的膜结构、纳米级的内吞囊泡。从肿瘤细胞分泌的EV与肿瘤发展、免疫逃逸和肿瘤微环境密切相关。EV含量丰富、稳定，并包含反映其起源细胞的独特蛋白质和核酸（例如DNA、mRNA、miRNA和lncRNA）成分。新出现的证据表明，来自外周血的长链非编码核糖核酸（lncRNA）是潜在的肿瘤生物标志物。LncRNA被定义为最小长度为200个核苷酸并且无蛋白质编码能力的转录物。LncRNA表达不仅可以区分正常人群和肺癌患者，还可以与肺癌的发生和发展相关。在之前的研究中，研究团队曾筛选了早期肺癌组织中差异表达的lncRNA，并证明这些lncRNA可能是临床上有用的早期诊断生物标志物。然而，由于难以从疑似患有肺癌的患者获得组织样品，因此需要开发循环EV-lncRNA作为生物标志物，将这种灵敏、准确且成本较低的方法用于肺癌诊断。

现有的lncRNA检测方法包括定量实时聚合酶链反应（qPCR）、微阵列、二代测序和表面增强拉曼光谱（SERS）。基于SERS的方法在早期检测中受限于SERS底物缺乏光谱再现性。基于二代测序的分子探测方法依赖于复杂的文库制备方案，并且需要高测序深度以实现高灵敏度。使用微阵列和qPCR方法，难以检测低拷贝数的靶标。据报道，EV中lncRNA的含量非常低，远远低于细胞中的mRNA水平。因此，需要一种更灵敏、准确、方便的定量方法来研究低丰度EV-lncRNA。

数字聚合酶链式反应（dPCR）是一种单分子检测技术。该终点法不需要标准曲线，对低丰度EV-lncRNA靶标定量能表现出高精度，并且对残留的PCR抑制剂具有抗性。然而，现有的dPCR系统涉及用于液滴产生、PCR循环和读出的若干复杂仪器。此外，商业液滴PCR系统的灵敏度和多路复用能力受每次运行可产生和分析的液滴总数的限制。因此，复杂的仪器、长时间的图像采集、低检测通量和高成本限制了dPCR的广泛实施。

图：miDER技术检测原理

为了解决这些局限性，在本研究中，研究人员开发了一种简单、灵敏、准确、高通量、低成本的微流体平台，命名为多色荧光数字PCR EV-lncRNA（multi-colour fluorescence digital PCR EV-lncRNA，miDER）分析，该系统可以快速实现芯片分析EV-lncRNA表达。由于单一标记物对肿瘤诊断的敏感性和特异性有限，而多个标记物的联合检测通常具有较高的敏感性和特异性，可进一步提高肿瘤诊断的准确性。miDER系统采用多重PCR技术结合微流控芯片对序列进行分区和扩增，可同时检测低水平的多靶点EV-lncRNA，提高检测通量、减少样品和试剂剂量。

结果显示，在miDER检测中，来自外周血的靶基因的检测上限为10拷贝/μL。在多重检测中，肺癌患者（n = 32）和健康对照组（n = 30）中两种肺癌相关lncRNA（SLC9A3-AS1和PCAT6）的表达水平在两组之间存在显著差异（P <0.001）。使用受试者操作特征（ROC）曲线分析来评估这些lncRNA的识别能力。在miDER检测中两种lncRNA的组合产生更高的曲线下面积（AUC）值0.811（95％CI = 0.705-0.918）。此外，为了确定miDER测定的绝对定量能力，研究人员将这些结果与qPCR获得的结果进行比较，证明miDER测定比qPCR更敏感。基于miDER的多重检测可为体液中极微量EV-lncRNA的多指标联合检测提供新的解决方案，并证明EV-lncRNAs作为肺癌检测生物标志物的应用。

参考文献：Bai Y, Qu Y, Wu Z, Ren Y, Cheng Z, Lu Y, Hu J, Lou J, Zhao J, Chen C, Mao H. Absolute quantification and analysis of extracellular vesicle lncRNAs from the peripheral blood of patients with lung cancer based on multi-colour fluorescence chip-based digital PCR. Biosens Bioelectron. 2019 Jul 17;142:111523.

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