说超滤离心管能够浓缩细胞培养液

bobo

那么，我看到有的师姐用超速离心管离心DNA，那么exosome算是什么呢，选择的分子量是根据什么选择的呢，离心后，超滤离心管中的exosome用什么重悬呢?

dancing

六月の雪 发表于 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具 ...

请问你是按照浓缩之后的体积加的SBI的试剂吗，比如40ml浓缩到了5ml，就加1ml的试剂，对吗

六月の雪

最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具体原理，尝试了再说
我用了40ml培养基，3000转离心了大概25-30分钟，浓缩到5-7ml的样子，然后加SBI试剂过夜，可以看到少量沉淀，下周做电镜鉴定

bobo

六月の雪 发表于 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具 ...

等你的好消息啊，我也准备做呢.那你用的什么牌子的超滤离心管啊

seallin

浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好

bobo

seallin 发表于 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好 ...

跟kit没关系啦，浓缩培养液的目的是想让其中的exosome浓一些

六月の雪

seallin 发表于 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好 ...

浓缩我个人觉得就是把培养基里的水去掉一部分，exosome浓度提高了不少，再加Kit我才能看到肉眼可见的沉淀，不浓缩直接加Kit也试过，根本没结果，那实验就更做不下去了....

六月の雪

bobo 发表于 2015-5-30 19:48
等你的好消息啊，我也准备做呢.那你用的什么牌子的超滤离心管啊

millipore超滤管

evomicscience

The naked pellet means that there is a lot of contamination. Did you do BCA protein assay and NTA? The ratio will tell you a lot.
John

bobo

evomicscience 发表于 2015-6-1 05:54
The naked pellet means that there is a lot of contamination. Did you do BCA protein assay and NTA? T ...

什么意思？

evomicscience

exosome amount from 40 ml of cell culture supernatants should be seen by naked eyes. The while pellet is because of leftover PEG bound to proteins/lipid, of course exosome microvesicle too. Ultracentrifugation of 40 ml of cell culture supernatants will give you less pellet but transparent. If you do NTA (counting particle/exosome absolute number) and protein assay, the ratio NTA/protein of the different isolation method will tell you which one is purer and which method is reliable.
Best,
John