有点不是很理解

liuhaoisboy

至少70ml的条件培养基（至少7个10cm的培养皿 和 20个15cm的培养皿）。10cm的培养皿不是就有10ml培基了，7个就是70ml，为什么还要and 20个15ml的培养皿呢？

还是我理解有误。

大家制备提取外泌体的细胞上清液时，一般用多少细胞培养，培养多长时间？ 我看文献，有48小时的，有72小时的。还有细胞培养达到80-90%的汇合程度的。

请论坛的大神，答疑解惑。谢谢啦~

hzangs

yy8651 发表于 2015-12-13 14:42
只是担心一直这样养下去会影响细胞，毕竟有文献说超离的培液会对细胞增殖有些影响，长期用的话担心有问题 ...

一篇nature的子刊  paper method里说 用2ml CM 超离分离exosome 可以看到沉淀。   信不？

paper不能尽信， nature的子刊 尚且如此， 更何况一些小paper…  很多时候 paper的结果都是值得商榷的，自己实验 验证之后 再决定如何去做。

我样的tumor cell 超离处理的培养基培养 这些cell，cell的状态很好， 而且lyden那边也是这么做的。 这些结果也仅限于我的cell， 所以在回复里 我也写的很清楚的， 我所描述的是我的方法。 我的方法能不能适用于你的细胞， 那还是需要你自己去尝试的。

hzangs

liuhaoisboy 发表于 2015-12-12 11:48
也有这个疑问。看文献没有提到要间隔培养的。

起始培养的细胞量跟你自己的细胞系生长性质有关， 我是使用的细胞 一般1个15cm dish 长满大约是1200W 细胞， 3天大约可以从50%长到95%  所以我最开始会铺大约500W-600W细胞。 你也可以根据自己的细胞来铺板。 因为我的细胞系 正常情况下就是3天传代一次 换配液，所以我加入配液的量也没有什么变化。
因为tumorcell 很坚强的，所以 配液一直使用超离去除exosome的配液，对细胞生长没有什么影响。
其实吧 一般文献里都不会给你提及这些细节的。很多时候 paper里的protocol 都会故意隐去一些关键细节  让人很无奈……  这个细节是去过lyden实验室的朋友告诉我的

hzangs

翻译一下：使用足够量的细胞来产生至少70ml的培养液（最少7个10cm dish 最多可以到20个 15cm dish）；通常情况下，纯化产量会随着其实培液体积的增大而增加，所以从大体积的培养液里纯化exosome会更好。

7个10cm dish 基本就是70ml  所以这段话里说  至少使用70ml培液。 而由于超离机器的限制，所以一般20个15cm dish的培液  是上限，再多的培液  一次就处理不完了。

通常情况下根据自己的实验具体安排培养时间。 我做tumor cell的 细胞比较坚强  72小时 不换液  没问题的。 所以我都是72小时。  我一般是50%的密度铺板，然后3天长到约90%-95% 然后收培液 同时传细胞重新到50% 开始进行下一个72小时培养。

希望可以帮到你

yy8651

hzangs 发表于 2015-12-11 22:12
翻译一下：使用足够量的细胞来产生至少70ml的培养液（最少7个10cm dish 最多可以到20个 15cm dish）；通常 ...

这期间全部都是经过超离去Exosome的培养基吗？不需要用完全培养基间隔？

liuhaoisboy

hzangs 发表于 2015-12-11 22:12
翻译一下：使用足够量的细胞来产生至少70ml的培养液（最少7个10cm dish 最多可以到20个 15cm dish）；通常 ...

恩，确实有帮助。谢谢解惑！请问，你起始细胞数量是多少啊，5X105？控制在生长72h达到90-95%汇合吗。培基的量还是按照正常培养时的量添加么？

liuhaoisboy

yy8651 发表于 2015-12-12 01:25
这期间全部都是经过超离去Exosome的培养基吗？不需要用完全培养基间隔？

也有这个疑问。看文献没有提到要间隔培养的。

hzangs

yy8651 发表于 2015-12-12 01:25
这期间全部都是经过超离去Exosome的培养基吗？不需要用完全培养基间隔？

同上

yy8651

hzangs 发表于 2015-12-13 11:48
同上

只是担心一直这样养下去会影响细胞，毕竟有文献说超离的培液会对细胞增殖有些影响，长期用的话担心有问题。

yy8651

hzangs 发表于 2015-12-13 22:44
一篇nature的子刊  paper method里说 用2ml CM 超离分离exosome 可以看到沉淀。   信不？

paper不能尽信 ...

hzang说的很有道理，我确实看到过你说的这个，也一直很奇怪，很多文章说的Exosome的实验，看起来好像很简单啊，好像很少样品都可以拿到很多Exosome，一直不解，你的话让我茅塞顿开。感谢