一种从脑组织中富集外泌体的严格方法

Johnny · 发表于 2018-6-13 17:13:05

一种从脑组织中富集外泌体的严格方法

包括外泌体在内的细胞外囊泡可由包括神经系统在内的所有细胞释放。它能够将脂质、蛋白质和核酸递送到附近和远端细胞，已有研究表明外泌体在许多神经系统疾病的进展中起作用。迄今为止，大多数关于这些囊泡在健康和疾病状态中的作用的分析都依赖于研究来自体外来源的囊泡，例如条件细胞培养基或体液。

墨尔本大学的研究人员采用了一种关键的方法来富集和表征来自人类额叶皮层的外泌体。该方法保持了囊泡及其货物的完整性，并且全面的蛋白质组学和基因组表征证实了所得细胞外囊泡作为内体衍生的外泌体的可靠性。这种方法将使神经科学家能够获得关于大脑外泌体的更详细的信息，并探索这种细胞间通讯形式的作用，以及脂质、蛋白质和RNA的独特来源在健康的大脑功能和疾病状态下的作用。此外，该方法对于从其他组织中分离外泌体可能具有重要的借鉴意义。

从固体脑组织分离外泌体的方案示意图

简单来说，分两步：

第一步、通过消化组织得到含有细胞外囊泡的上清液；

第二步、通过三重蔗糖垫超速离心法分离外泌体。

详细方案如下，

将新鲜冷冻（-80°C）人额叶皮质在冰上用剃刀刀片切片，产生1-2cm长、2-3mm宽的切片。冷冻切下的切片组织用75 U/mL 3型胶原酶在Hibernate-E中、37°C条件下消化20分钟。消化后立即将组织放回冰中，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。将组织在4℃下以300×g离心5分钟（沉淀用作脑匀浆+胶原酶对照），将上清液转移至新管中，在4℃下以2000×g离心10分钟，然后在4℃以10,000×g离心30分钟。将含有EV的上清液覆盖在三重蔗糖垫（0.6M，1.3M，2.5M）上并以180,000×g超速离心3小时分离囊泡。弃去梯度的顶部，收集指定为1,2和3的级分并测量折射率。将每个级分进一步以100,000×g超速离心以沉淀每个级分中所含的囊泡。每个样本均通过包括电子显微镜、RNA和蛋白质分析在内的技术组合进行验证。注意：一些组织样本不适合这种方法。取样时间、储存时间和冻融循环次数会对组织质量产生负面影响，并导致细胞碎片和非外泌体囊泡对组分产生污染。

外泌体被富集到第二个组分中

参考文献：

Vella LJ, Scicluna BJ, Cheng L, Bawden EG, Masters CL, Ang CS, Willamson N, McLean C, Barnham KJ5, Hill AF. (2018) A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles 6(1):1348885.

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