Nature Protocols：无损生产超薄钯纳米片外泌体

Johnny

Nature Protocols：无损生产负载有超薄钯纳米片的外泌体，用于靶向生物正交催化

近日，Nature Protocols杂志上发表文章，报道了一种不破坏外泌体膜、无损生产负载有超薄钯纳米片的外泌体方法，用于靶向生物正交催化。
   
生物正交化学通过允许原位合成可用作探针的功能分子，以提供有关正在进行的生化过程和/或能够调节生理或病理过程的药物的信息，为医学界提供了令人兴奋的机会。与化学的其他领域一样，在生物正交的场景中，催化的使用对于促进选定化学反应的多个循环是有效的，并且正在针对不同的应用广泛探索这种方法，从而产生了生物正交催化的子领域。尤其是钯（Pd），由于其具有实现多种反应的灵活性（例如，脱烷基反应、交叉偶联反应、成环和裂解），通常被用作催化剂。肿瘤内Pd催化化学反应从毒性低的分子中原位产生有毒物质（例如通过催化解笼反应）将在肿瘤学领域引起极大兴趣，因为药物的全身性给药将被局部肿瘤内产生所取代，可将副作用降低多个数量级。
尽管已经在体外、离体和体内获得了概念验证证明，但在体内使用生物正交催化化学仍面临巨大挑战。需要克服的主要障碍是必须将催化剂（例如Pd纳米颗粒）选择性地递送到生物体内的靶细胞或组织。研究人员通过使用纳米级载体进行选择性药物递送已经长期面临着类似的问题，而肿瘤通常是封装药物的靶标。为了应对这一挑战，尽管递送效率很低，但开发了一系列基于纳米颗粒的药物递送系统（有机和无机的，具有多种隐身层和靶向部分），但递送效率很低：平均而言，不到1％能到达肿瘤，甚至对于高度复杂的抗体结合纳米颗粒。
为了应对将Pd催化剂专门提供给癌细胞的挑战，该团队此前报告了使用癌症衍生的外泌体作为靶向载体系统（相关报道：https://www.exosomemed.com/6463.html）。基于外泌体的递送作为将催化剂递送至肿瘤的一种更有效的替代方式正在引起人们极大的兴趣。外泌体是纳米级的细胞外实体，由生物体中大多数细胞分泌的，长期以来，人们一直认为它们的主要功能是将不需要的物质丢弃到细胞外。如今，已知外泌体包含许多来自亲代细胞的关键成分，包括蛋白质、脂质和核酸，并在细胞间通讯中起关键作用。更重要的是，有强有力的迹象表明，外泌体膜可以赋予这些囊泡独特的识别特性，从而可以选择性地靶向其起源细胞。


用于靶向生物正交催化的Pd外泌体生产的示意图

该团队开发出一种方法，可以将Pd纳米片装载进多种细胞衍生的外泌体。合成程序基于原位还原通过事先在外泌体内扩散而封装的Pd金属前体。开发了一种温和的化学气相方法，以使Pd纳米片在外泌体内得以控制组装，而不会损害其完整性和功能性。将Pd前体加载到外泌体中的基于扩散的方法，使研究人员能够解决将外泌体用作催化传递载体时的主要问题：将所需的有效负载引入外泌体而不会破坏外泌体膜。该文提出了一个详细的protocol来创建外泌体-催化剂杂化物，该混合物保留了外泌体的固有特性并结合了催化剂的生物正交活性。

外泌体分离和Pd[size=0.625em]2+负载示意图

这篇protocol提供了有关有效方法的详细信息，该方法可在外泌体内部实现高负载的催化活性Pd纳米片而不会破坏其膜。该方案涉及一个多阶段过程，其中首先收获外泌体，用Pd盐前体进行浸渍，然后使用气相CO进行温和的还原过程，该气相CO既充当还原剂，又充当生长导向剂，以生产所需的纳米片。该技术是可扩展的，并且该protocol可由具有基本生物学和化学技能的任何研究人员在约3天内完成。

高压CO还原系统的示意图以及生产Pd外泌体的三通阀位置


Pro-Resorufin（阴性对照）、Resorufin（阳性对照）和Pro-Resorufin与催化的Pd-外泌体在24小时内的延时图片

步骤：
一、细胞培养准备
二、外泌体提取
三、外泌体定量
四、Pd装载进外泌体
五、高压CO还原系统的设置
六、高压CO还原系统中的Pd还原
七、外泌体的蛋白质印迹以确定膜蛋白的改变
八、外泌体中Pd含量的定量
九、外泌体的稳定性分析
十、细胞毒性评估
十一、共聚焦显微镜分析的细胞制备
十二、共聚焦成像的细胞免疫化学
十三、Confocal拍照
十四、电镜拍照
十五、体外催化研究
十六、延时成像
十七、细胞内催化研究
参考文献：SebastianV, Sancho-Albero M, Arruebo M, Pérez-López AM, Rubio-Ruiz B, Martin-Duque P,Unciti-Broceta A, Santamaría J. Nondestructive production of exosomes loadedwith ultrathin palladium nanosheets for targeted bio-orthogonal catalysis. NatProtoc. 2020 Nov 27. PMID: 33247282.附件已隐藏，回复该贴可查看附件  

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