超离提取exo底部沉淀问题

stones

210ml的MSC无血清培养上清，第一次离心的时候没有看到沉淀，最后用100ulPBS重悬，BCA测浓度在20ug/ml左右。接着又超离了210ml的上清，这次看到了沉淀，在离心管底部一圈白色的沉淀，最后用PBS重悬，不好溶，贴的很紧，最后用250ul的PBS连刮带吹打了50+次，转移到EP管内；浓度待测。请教各位，这个沉淀是不是exosomes？我这个浓度是不是太低了。

sldingxiang

看图片你用的应该是固定角的转子，沉淀不应该是在“底部一圈”，而是在 放置离心管时朝上一侧的壁和底部的交接部位。不知道表述的够不够清楚

stones

sldingxiang 发表于 2016-8-12 11:21
看图片你用的应该是固定角的转子，沉淀不应该是在“底部一圈”，而是在 放置离心管时朝上一侧的壁和底部的 ...

不是固定转子，是水平的，SW32Ti。

stones

哪位大神也看到过类似的沉淀啊？求解答。浓度是不是太低了呢？

hzangs

超离的血清么？

stones

hzangs 发表于 2016-8-16 16:59
超离的血清么？

是无血清培养的MSC。今天把有沉淀的那管exo（250ul PBS重悬的）测了浓度，在110ug/ml左右。比第一次测得高了10倍，但和论坛里其他人超离的比较起来，还是差了几倍啊。但是和Thery2006的经典protocol里的浓度比较：10·6个细胞得到0.5ug外泌体；我大概有10·8个细胞，210ml这次测得有110ug/ml*0.25ml=27.5ug，换算下来，10·6个细胞得到了0.275ug外泌体；这样比较起来也只差了2倍左右。坛子的高手们，我这个浓度到底是一个什么水平呢？求指导！蟹蟹

hzangs

stones 发表于 2016-8-16 23:16
是无血清培养的MSC。今天把有沉淀的那管exo（250ul PBS重悬的）测了浓度，在110ug/ml左右。比第一次测得 ...

分泌量和细胞类型 及细胞状态有密切关系。   
你超离完以后是倒的上清还是吸取的上清？

stones

hzangs 发表于 2016-8-17 09:44
分泌量和细胞类型 及细胞状态有密切关系。   
你超离完以后是倒的上清还是吸取的上清？ ...

超离后是用25ml的移液管吸得，按照protocol，第一次10万g超离后，弃去上清至0.5cm，PBS冲洗每管后转移到新的离心管。第二次10万g超离后，看见沉淀后用移液管吸大部分，剩余小部分用1ml枪头贴管壁和液面慢慢吸弃掉上清的。蟹蟹版主及时回复，110ug/ml这个浓度对于MSC的上清是个什么水平啊？

hzangs

stones 发表于 2016-8-17 09:49
超离后是用25ml的移液管吸得，按照protocol，第一次10万g超离后，弃去上清至0.5cm，PBS冲洗每管后转移到 ...

MSC 我没有试过。 但是按照johnny的说法  他之前做MSC 感觉分泌量还不错

stones

蟹蟹版主！打算按照你的建议再试一次。@Johnny，Johny大神求指导啊。