关于science上一篇paper的电镜图的疑问

躺在雪地里的羊

大家好，前段时间science发了一篇关于外泌体的文章，我对这篇文章的电镜图有些疑问。
这篇文章是从原代脂肪组织培养上清中分离的外泌体，分离的方法是凝胶排阻。电镜的具体流程摘录如下：
After collecting the exosome fraction from lean or obese adipose tissueconditioned medium, paraformaldehyde was added to each sample (2% vol/vol). Samples were airdried on Formvar-carbon-coated grids, negative stained with uranyl acetate, and washed. Gridswere examined under a JEOL JEM-1200 EXII electron microscope. Images were captured with anORCA-HR digital camera and recorded with image capturing software (AMT Image CaptureEngine, Advanced Microscopy Techniques, Corp).
电镜图中的bar是200nm，可以看到电镜中的囊泡基本都是圆球状，没有典型的茶托状的结构，并且尺寸也基本在50nm左右甚至更小。另外，和panel G中的NTA结果对比（mean diameter: 118 ± 57 nm; median: 102 nm），电镜的结果也偏小。
关于这样的结果，我主要有两个疑问：
1. 为什么TEM的结果会比NTA偏小？这是由于两种方式的不同测量原理所带来的系统误差吗？
2. 为什么TEM的结果显示出的尺寸、形状都与传统的认知不太一样，是因为凝胶排阻这一特定的分离方式造成的吗？我还看过其他一些文献，也是用凝聚排阻这一方法分离的外泌体，似乎展示出了相似的电镜特点。（Chang-Sook Hong, Sonja Funk, Laurent Muller, Michael Boyiadzis & Theresa L. Whiteside (2016) Isolation of biologically active and morphologically intact exosomes from plasma of patients with cancer, Journal of Extracellular Vesicles, 5:1, 29289, DOI: 10.3402/jev.v5.29289）
如有大神能帮忙解答，不胜感激！

hzangs

撇开这篇文章。 我先回答你的两个问题。
1、电镜粒径和NTA粒径的差别。 理论上讲，电镜的粒径确实会比NTA粒径偏小。这主要是因为电镜粒径主要反应的是纳米粒子在制片后的结构直径。脱水等环节还可能使粒径变的更小。 而NTA测试的是纳米粒子在液体环境中的直径，是通过布朗运动的规律折算粒子直径，这个过程中粒子表面的结合水也会算入粒径中。因此NTA计算的是水合粒径。因此两者会有差异。
2、我们做过尝试，使用PEG、超速离心、凝胶排阻等各种方法进行囊泡分离。但是，无论通过什么方法进行囊泡的分离，负染电镜结果都是很明显的囊泡结构。都会具有茶托样的特征。换句话说，电镜下的形态与你的分离方法无关。

再回到这篇文章。
这篇文章出来的时候我们团队内部也进行了讨论。目前我们认为这个图片是有问题的，主要有一下几点。1、他们做的脂肪细胞来源的囊泡，但是这个并未排除是否是脂滴。2、粒子直径明显存在问题，视野中的粒子直径普遍在50nm一下，即使考虑水合直径  这个数据也不应该差这么多。 3、电镜下的粒子结构是匀质结构，与常见的外泌体明显不同。
考虑到外泌体作为一种中空的囊泡，它内部应该存在不同的物质分子，因此它在电镜下的结构不可能是匀质的。  另外考虑到这篇文章的研究对象是脂肪细胞，所以我们怀疑这张电镜图可能观测到的是脂蛋白颗粒，或者脂肪微滴。  其实这篇文章也给很多初学者带来了很大的疑问。  
虽然这篇文章发表在science上，但是我们认为外泌体鉴定这一部分的数据是值得商榷的。这也是为什么ISEV在推荐自己制定的一些鉴定策略。 囊泡领域近些年刚刚起步，很多方面还有很多不规范的事情。之前很多文章中都出现过类似的电镜图。很多paper中也存在明显的疏漏。  因此建议新入门的朋友们先读一些方法学讨论的文章。 建议初学的朋友们从thery 2006年的protocol读起，之后再看一看MISEV2018  以帮助自己尽快了解这一行业的一些问题，避免进入一些大坑。

baishixiaoyaozi

凝胶排阻色谱只能根据颗粒大小进行分离。
某些样品如血浆，以及文中所提到的原代脂肪细胞培养液上清中还含有大量的脂蛋白（lipoprotein）颗粒，这些颗粒的大小与外泌体相仿，凝胶排阻色谱就没法将其区分开。不知道文章作者有没有检测样品中是否含有lipoprotein。
另外，看文中脂肪细胞来源外泌体的示意图，其中还有脂肪滴（lipid droplet），这些脂肪可能再固定的时候溶于固定液中。进而导致外泌体体积变化。

hereissyk

补充一点，茶托样结构是复染这个操作造成的，与分离方法无关，冷冻电镜做出来的就是圆滚滚的。

baishixiaoyaozi

1. 为什么TEM的结果会比NTA偏小？这是由于两种方式的不同测量原理所带来的系统误差吗？
我问过电镜室的工作人员，他们的解释是和样品制备方法有关，固定过的样品因为脱水的缘故会缩小。

baishixiaoyaozi

https://www.tandfonline.com/doi/ ... 013078.2018.1560809
这篇文章比较了超离以及凝胶排阻色谱这两种方法分离的血浆来源外泌体（如得率，纯度，和生物学功能等等）。

躺在雪地里的羊

baishixiaoyaozi 发表于 2019-4-2 01:12
凝胶排阻色谱只能根据颗粒大小进行分离。
某些样品如血浆，以及文中所提到的原代脂肪细胞培养液上清中还含 ...

非常感谢您的解答，也感谢您分享的文章！那一般是通过检测apoB的水平来检测lipoprotein的污染吗？还有就是关于电镜下exosome形态的问题，这篇文章里的电镜里都是比较均质的球结构，难道它们都是lipoprotein吗QAQ

躺在雪地里的羊

hzangs 发表于 2019-4-2 12:05
撇开这篇文章。 我先回答你的两个问题。
1、电镜粒径和NTA粒径的差别。 理论上讲，电镜的粒径确实会比NTA粒 ...

非常感谢您细致的解答还有您的建议！学习啦！非常感谢~

躺在雪地里的羊

hereissyk 发表于 2019-4-9 09:43
补充一点，茶托样结构是复染这个操作造成的，与分离方法无关，冷冻电镜做出来的就是圆滚滚的。 ...

谢谢您的补充！感谢！

hzangs

hereissyk 发表于 2019-4-9 09:43
补充一点，茶托样结构是复染这个操作造成的，与分离方法无关，冷冻电镜做出来的就是圆滚滚的。 ...

圆滚滚。  让我想到了熊猫