为什么鉴定外泌体需要同时使用电镜、NTA和Western Blotting

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细胞外囊泡是近些年的研究热门领域，细胞外囊泡主要包含微囊泡和外泌体两个大类。而外泌体是目前最受追捧的细胞外囊泡类群。它在诸如生物标志物、活性分子递送和生理病理调控中的研究报道不绝于耳，不乏诸如Nature、Science、Cell级别的重量级报道。相信很多朋友阅读过相关的论文。

朋友们在阅读论文过程中肯定发现了一个规律，无论是什么级别的杂志，外泌体的鉴定通常都是保留节目。这是因为目前外泌体的分离鉴定依旧存在较高门槛。此外，研究者制备的外泌体样品纯度和完整性还会直接影响实验结果，最终影响论文的结论。因此，外泌体的鉴定就必不可少了。

为什么外泌体鉴定要做电镜看形态、NTA测粒径分布、WB检测标志蛋白三个实验呢？

主要原因有二。一、因为目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品，因此要通过多种实验来评估外泌体样品的纯度和完整性；二、目前没有任何一个单一实验可以准确鉴定外泌体的存在、数量和完整性。外泌体的鉴定是为了评估研究者对外泌体分离纯化的效果，通过不同的实验评估富集的外泌体样品中外泌体的存在、数量和完整性。这是后续所有实验的必要前提。

虽然目前外泌体的分离方法可谓“八仙过海，各显神通”，但是现有的任何一种方法分离的外泌体样品都难以做到极高纯度，多多少少都会残留有非外泌体成分的杂质。比如超速离心和凝胶排阻层析都不能很好地去除血清中低密度脂蛋白颗粒，即使使用梯度密度离心也是一样。此外，诸多外泌体的分离纯化方法在操作上都相对繁琐，并且具有一定的难度。这些条件决定了研究者需要在论文中展示自己制备的外泌体样品鉴定结果，以保证后续实验确实是建立在“已经准确的分离纯化了外泌体”这一基础之上。

目前鉴定外泌体主要包括三方面实验，但是三方面实验在鉴定外泌体的存在、数量和完整性上分别存在一些缺陷。电镜成像可以直观的看到粒子的形态，因此可以用于鉴定外泌体的存在和完整性，但是包括支原体、铁蛋白聚团、聚乙二醇蛋白聚团、溶酶体等的电镜图片与外泌体都十分相似，并且电镜只能展示局部景象。因此，电镜成像无法区分外泌体及形态相近的纳米粒子，且不能反映样品中的外泌体数量。NTA是一种测算粒子群体直径分布和粒子数量的计算方法，它通过光学原理感知粒子的存在，因此可以确认外泌体样品中的“外泌体”数量和直径的群体特征，但是无法确认检测到的粒子是否为外泌体，不能反映粒子形态，无法将外泌体和其他纳米粒子区分开。因此NTA不能确认外泌体的真实存在和外泌体的完整性。WB可以鉴定外泌体中存在的特定蛋白，WB检测外泌体标志蛋白可以说明外泌体成分的存在。但是目前的这些标志物蛋白只是会在外泌体里富集，而并不是外泌体所特有的，诸如CD63、ALIX等在细胞中都有，在一些细胞碎片、溶酶体、胞内体中也大量存在。因此，WB仅能证实外泌体成分的存在，无法确认外泌体的数量和完整性。因为上述原因，所以国际细胞外囊泡协会才发布了一些指南，在指南中给定了这三个实验联合鉴定外泌体的方法。通过三个实验相互佐证来确认外泌体的存在、数量和完整性。其中的逻辑是这样的：电镜观察到样品中存在类似外泌体的经典结构，同时WB检测发现样品中富集外泌体的标志物，那就一定程度说明样品中存在外泌体且外泌体完整。但依旧不知道样品中外泌体的数量，电镜和WB的连用只能证明你的样品中外泌体的存在和完整性；所以就引入了NTA实验，通过NTA测算粒子数目，统计直径分布以确认是否符合外泌体的定义，在粒子群体层面再给予样品一个评价。因此，当且仅当三个实验结果都正常（即电镜看到经典结构，WB检测到外泌体标志物的富集，NTA测算直径分布符合外泌体定义），才能确认研究者成功的分离纯化了外泌体，基于这一成功的分离方法所得到的后续研究结果才能认为是外泌体相关的研究结果。其实，最好完美的鉴定方法应当是免疫电镜结合NTA，但是免疫电镜的难度过高，因此最终形成了电镜、NTA和WB三个实验鉴定外泌体的主流共识。虽然原理都懂。但是电镜的负染是一个技术活，NTA需要价格高昂的专业仪器，WB则需要使用数个抗体（检测完后基本再也用不到了）。很多朋友三个实验可能会折腾进去半年，最后也没办法确定到底是自己没有拿到外泌体还是鉴定实验没做成功……钱花了，却没有结果……只能是丈二的和尚摸不到头脑。“为大家提供最前沿的资讯，协助大家做更好的科研”这一直是外泌体之家团队的宗旨。节约大家的宝贵时间和经费才是王道。因此，外泌体之家推出了鉴定技术服务。您只需要提供样品。外泌体之家团队将为您对接专业且可靠的电镜、NTA、WB分析平台，直接将最终的分析报告交到您的手中！省去您摸索实验的大量时间，让您的宝贵时间投入到更有意义的思考中去！
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