外泌体提取蛋白做western检测标记物

小孔加油 · 发表于 2016-6-22 20:28:25

各位同行，在采用超速离心发提取外泌体后，提取蛋白，western测CD63和CD9，最后结果没有跑出条带，考虑是不是浓度太低的缘故，可看文献中报道的结果都很好。请问各位有没有遇到这种情况，是如何解决的。非常感谢！

五月灼蓁 · 发表于 2017-5-19 19:01:49

Johnny 发表于 2016-6-24 17:24
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB

你好，想请问一个问题，我看到网站里有人说要用非还原性的loading buffer,那配裂解液的时后是不是不加DTT就可以了

小孔加油 · 发表于 2016-6-25 09:24:34

谢谢解答！

小孔加油 · 发表于 2016-6-25 09:27:18

Johnny 发表于 2016-6-24 17:24
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB

请问一般加多少裂解液或者loading buffer?

18940258208 · 发表于 2017-5-30 16:55:05

Johnny 发表于 2016-6-26 12:08
这看你外泌体量多少啊少加点儿 100微升试试呗

你好，我想求助！关于exosome蛋白的western blot，我做的是CD63的鉴定，用的是Qiagen厂家的exoEasy Maxi kit试剂盒提取的细胞上清15ml的外泌体（共6个不同时间点的样本），最后溶于500ul XE buffer。前后一共做了6次WB，起初是没有用裂解液，配的10%胶，直接取20ul加相应的loading buffer，100度变性后上样，然后出来的条带是连续一条直线，之后改了各种试剂及条件，仍是一条线，我怕是自己的技术问题，同时期同条件下还跑了以前剩余的普通蛋白标本，杂的是GAPDH，跑出来的泳道间隔都没问题，证实我的技术还行。于是在最后一次加了裂解液（MPER+PMSF）后，显影竟然是白板，Oh MY GOD，我想死的心都有了。也翻阅了好多文献，但是都不是说的很具体详细