感觉电镜做废了

pytruth

小弟刚开始做细胞上清外泌体，最近老板跟锐博挺熟的，让试试锐博的exosome提取试剂，我用9ml细胞培液提出来exosome，肉眼不可见，用的40ulPBS重悬，但测了蛋白浓度能到2ug/ul，NTA检测峰值在190多，不知道正常吗？电镜制样采取牛人hzangs的方法，请一个师兄帮我染的，吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟上机，
镜下发现铜网的膜破了，几乎就没找到像样的外泌体，不知道是不是因为浓度太高了？电镜图见下，请各位牛人帮小弟看看都是什么东西？

hzangs

铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量过高，干燥过程中蛋白张力拉扯铜网破裂的。 也就是说样品中杂蛋白太多了。
第一张的黑团子尺寸是对的，但形态不对，边缘不光滑，有可能是高聚物结晶或者是其他颗粒。第二章的那一个如果按照下方标注的比例尺估算大概在60nm 直径，形态上看上去可能是,但是 孤木不成林，我不敢说它就是或者就不是 。 剩下的图片里  都不是外泌体。

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 10:14
铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量 ...

谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片吗？

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 14:55
谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片 ...

我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的试剂盒，还不如自己配PEG  便宜又好用

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 15:08
我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的 ...

好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个外泌体？
2.hzangs用过IZON的qEV吗？外泌体得率是不是要比高速离心法低？
3.现在用什么方法提取外泌体能兼顾得率和外泌体质量？
4.如果用超速离心或者qEV等方法会破坏外泌体的膜结构吗？
5.假如我要了解两组不同处理的同种细胞外泌体分泌的差异，现在有什么方法能够对比哪种处理使细胞分泌的外泌体增加或减少？

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离我尝试过。电镜分析 直径300-400nm的microvesicles挺多。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离的商业化我尝试过，电镜分析 直径300-400nm的microvesicles太多，不能够拿到外泌体组分，只能拿到囊泡组分，你可以考虑自己更换柱材，选择更好 的柱材自己制作排阻柱进行分离，有相关的paper你可以自己查一查。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。不同的计数方法有些偏向于检测的粒子确定是外泌体，有些检测方法偏向于检测粒子数目的准确性，关于最后一个问题，你要自己去查看paper，目前没有太好的外泌体计数方法，很难兼顾特异性和准确性。

kasangzc

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要 ...

你的意思是 qEVD得到的样品直径太大吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要 ...

好的，非常感谢！能多问一下，能否把您细胞上清超速离心的操作流程提供一下参考一下吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高， ...

还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？