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急!这是我整理的细胞免疫荧光步骤,大神帮我看看

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发表于 2017-12-22 11:59:17 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
细胞免疫荧光实验步骤,请大神帮忙看看有没有错的或需要注意的
1. 六孔板中将已爬好细胞的玻片预温好的PBS浸洗3次;
2. 4%的多聚甲醛4℃固定15minPBS浸洗玻片3次,每次5min
3. 0.2%Triton X-100( 4uL+4mLPBS )室温通透15min
4. PBS浸洗玻片3次,每次5min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加封闭液(1%BSA in PBS + 0.05% Tween 20即0.1gBSA+10mLPBS+5uL Tween 20),室温封闭1h,封闭液浸没爬片;
5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗β-actin(封闭液稀释至5 µg/ml,稀释浓度依据的说明书)并放入湿盒,4℃孵育过夜;
6. PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水纸吸干爬片上多余液体
7. 滴加稀释好的荧光二抗,FITC标记山羊抗小鼠IgG (H+L)稀释比例为1:500(用上述封闭液稀释),湿盒中37℃孵育1h
8. PBS浸洗3次,每次5min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
9. 用吸水纸吸干爬片上的液体,滴一滴(20-50μl) 抗荧光衰减封片剂(DAPI)于载玻片上,镊子小心夹起爬片,盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片液,尽量避免气泡。 随后即可通过荧光显微镜观察样品。

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沙发
发表于 2017-12-28 14:38:31 | 只看该作者
我染核也是用的封片,但是染出来的核颜色分布不均匀,大家有遇到过类似情况吗
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