本帖最后由 hzangs 于 2018-1-11 11:21 编辑
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在外泌体被发现后的十多年来，人们一直认为外泌体仅仅是清除废弃蛋白质过程中的一部分，但是后来证明外泌体不仅仅是垃圾箱，而且它们在免疫系统内的细胞间通讯中起作用，并可运输mRNA和microRNA等功能性分子。目前已知胞外囊泡（EVs），包括外泌体，携带特定的蛋白质、脂质和核酸，并且在生理和病理生理条件下从几乎所有类型的细胞中主动释放到细胞外空间和体液中。该研究的目的是验证在无创产前诊断领域中常规使用的母体血液中循环的无细胞胎儿DNA可以被包装和保护在纳米囊泡——外泌体中的假设。
在EVs研究领域，已经发表了许多不同的分离方案，但最常用的仍然是差速离心方案。在该研究中，使用差速离心和0.2μm过滤步骤的超速离心从孕妇的血浆和血清样品中分离外泌体，并消除其他类型的囊泡（凋亡小体和微泡）污染外泌体。为了纯化分离的EV，将它们重新悬浮在PBS中进行第二次超速离心（去除污染的可溶性蛋白质的洗涤步骤）。接下来，通过标准实验程序来鉴定分离的EV。蛋白质印迹分析证实存在跨膜或脂质结合的细胞外蛋白质-CD63和CD81。内涵体或膜结合蛋白-TSG101和flotillin也存在，根据Uniprot数据库，TSG101的主要分子功能之一是结合DNA。该实验的样品中，Calnexin是一种胞外蛋白，不存在于外泌体中，而是存在于其他类型的囊泡中，这意味着产量仅由外泌体组成[3]。电子显微镜也证实了外泌体的存在，RNA分析的结果显示分离的囊泡含有RNA，并且具有典型的外泌体RNA的大小轮廓——大部分是小RNA，少量或不含核糖体RNA。
在分离的囊泡鉴定为外泌体后，提取其DNA，并使用两种不同的DNA检测标记来区分胎盘DNA和与血浆和血清外泌体相关的总DNA。使用雄激素受体基因（AR）作为总DNA检测的标记。结果证明，从母体血浆和血清分离的外泌体含有DNA。在从母体血清外泌体中分离出的DNA样品中，平均检测到总DNA的667.41 GEq/mL（SD≈207.96 GEq / mL）。在血浆囊泡中检测到的总DNA量较少，平均为77.97 GEq / mL（SD≈38.87 GEq / mL）（表1）。这表明测量的DNA的量可能受血样制备方法的影响。尽管用EDTA将血浆样品吸入管中并立即离心以避免细胞裂解，但是血清样品没有任何抗凝剂被吸入管中。收集全血后，在室温下静置，使血液凝固。在凝血过程中，可能释放母源囊泡，导致在血浆和血清样品中检测到的总DNA量的差异。以前的研究同样表明从血清中分离的无细胞DNA的浓度高于从血浆中分离的浓度。体液的类型以及从样品收集到DNA分离的选择的DNA分离方法和时间是影响血浆和血清无细胞DNA浓度的重要因素。
从母体体液外泌体分离的总DNA分析同时，还确定了胎盘来源的DNA的存在。为了特异性检测胎盘来源的DNA，使用了Y染色体上DYS14基因区域的特异性标记物。怀有男性胎儿的孕妇血浆和血清中检测到胎盘来源的DNA平均1.70 GEq/mL（SD≈1.31 GEq/mL）和0.94 GEq/mL（SD≈0.52 GEq/mL）。在怀有女性胎儿的孕妇样本中，没有检测到与Y染色体特异性标记对应的信号。在这种情况下，从血浆囊泡中分离的胎盘DNA的量高于血清囊泡，这证实了该研究的建议，即在凝血时间期间血清样品中的囊泡在收集后被释放。血清样品中总DNA的量较高可能是由于体外凝血过程中白细胞裂解产生的基因组DNA污染引起的。这些发现与其他研究一致，其中对在母体血浆和血清中循环的胎儿来源的无细胞DNA进行定量。血清样本中总循环胎盘特异性DNA的量低于孕妇的血浆样本。同样，血浆总DNA中胎盘特异性DNA的百分比低于总DNA中的百分比。
然而，检测到的外泌体相关DNA浓度相对于孕妇血浆和血清中普遍循环的DNA浓度相对较低。在我们的研究中，直接从血浆或血清中分离的母体和胎儿来源的总无细胞DNA量分别是血浆样品中的10和11倍，血清样品中母体和胎儿来源的总无细胞DNA量分别比包装到外泌体中的高14和25倍。这可能是由于一部分循环的细胞外DNA可能位于外泌体样囊泡内，其余的无细胞DNA可能位于外泌体表面。
以往的研究表明，无细胞DNA可能与EV外部相关，这可能会导致这些EV的聚集，可能影响EV在受体细胞的作用。然而，在该研究中，即使在DNAse I处理之后，也能够在分离的外泌体中检测母体和胎盘来源的DNA，其消除了定位在囊泡表面上的细胞外DNA。这表明DNA被包装并保护在囊泡内部。在胰腺癌患者的血浆来源的外泌体的研究中也显示了这一点，其中DNA酶I处理也被用于在囊内容物的分析中避免外部DNA污染。
怀孕与孕妇血液中外泌体数量的显著增加有关。滋养层细胞释放的外泌体携带与胎盘生理学相关的功能分子，在细胞间通讯中起关键作用。以前的研究已经确定了从胎盘释放的外泌体蛋白，以及生物活性脂质和胎盘特异性miRNA的存在。本研究获得的数据表明，从孕妇血浆和血清中分离的外泌体不仅含有母体，而且含有胎儿来源的DNA。尽管本研究存在局限性，如胎盘外泌体缺乏更详细的规范，但仍为进一步研究囊泡在健康和复杂妊娠中的定位和功能提供了基础。对于未来的研究，揭示胎盘外泌体是否转移到其他生物体液如唾液或尿液中也是重要的，这些生物体液在产前筛查和诊断中也可能是临床实用的。
参考文献： Repiská G, Konečná B, Shelke GV, Lässer C, Vlková BI, Minárik G.Is the DNA of placental origin packaged in exosomes isolated from plasma and serum of pregnant women?Clin Chem Lab Med. 2018 Jan 8. pii: /j/cclm.ahead-of-print/cclm-2017-0560/cclm-2017-0560.xml. doi: 10.1515/cclm-2017-0560. [Epub ahead of print]
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