本帖最后由 hzangs 于 2015-11-1 15:12 编辑
经过了长时间的整理，我整理了一份相对全面的试用报告供大家参考。
相信从事exosomes相关研究的同事们都有一个非常苦恼的问题：超离分离步骤繁琐、操作复杂。试剂盒沉淀分离产物不纯，实验结果容易被审稿人质疑。我也不例外，自从使用kit沉淀从10ml细胞培养液中分到近1mg“exosome”之后，我就再也没有使用过kit，从事exosomes相关研究一年多以来一直忙碌在超速离心机旁，仪器预约平台超速离心机经常被我整天占用，仪器使用记录中一直被我的名字刷屏，不止一次被其他组的同学误会我胡乱占用仪器。哎，做常规课题的人怎么能明白分离exosomes的痛苦……因此我也一直在尝试寻找一些可以替代超离分离的技术。
在今年6月份从Izon公司了解到了qEV分离柱，并在今年9月初进行了qEV分离柱的试用，在这里将试用心得分享给大家，同时简要分析一下从我个人角度来看，qEV分离柱优缺点。最后会附一份protocol 给有试用装的同学做一个参考。
根据Izon公司的介绍，我们大体可以猜到qEV分离柱应该使用的是“凝胶排阻层析”的思想，但是目前具体使用的柱床材料我还不得而知，估计这个应该属于Izon公司的商业秘密，这里也不做过多猜测。对于没有做过生化分离试验的同学们来说“凝胶排阻层析”可能不太清楚，我在这里做一个简要介绍，凝胶排阻层析主要是通过多孔材料作为柱床材料，在样品分离的时候体积较小的组分会被洗脱液冲到多孔材料的孔里再进一步被冲出来，而体积较大的组分不能进入多孔材料的孔内只能通过材料之间的缝隙通过。这样的过程中，大体积组分通过分离柱时所走的路程较短，会首先被洗脱下来；小体积组分所走路程较长，会晚一些被洗脱下来。 原理如下图，通过选取不同孔径大小的材料，可以达到特异性分离某一组分的目的。 简介到此，同学们想知道更多情况，可以问一问google或者百度。
下面介绍一下我的对比试验设计思路。
我首先使用含有exosome-freeFBS的培养液培养A549细胞 72小时（15cm dish 共6盘, seedas 50% coverage到72小时基本刚好100%），收集培养液共100ml，去除死细胞和细胞碎片，平分成两份。一份使用超速离心分离培液中的exosomes；另一份使用millipore超滤管5000g，20分钟浓缩后，平分成两份，前后两天使用同一根qEV柱进行exosomes的分离纯化。通过蛋白定量和粒子浓度监测反应exosomes的总量，通过WB监测exosomes marker（ALIX TSG101）。综合分析结果评判qEV分离柱的优劣。
超离得到的exosomes使用PBS清洗了2遍，qEV分离得到的exosomes没有做任何处理。
ps：qEV分离柱使用手册上说，exosomes主要存在在上样后第3-第4ml的1ml洗脱液中。
首先我使用BCA定量对分离得到的不同的组分中蛋白质的总量进行了测定。可以看到最左侧bar是超速离心得到的外泌体的总量，在15ug左右。之后8个bar的前4个是第一次使用qEV分离得到的不同组分，后四个是第二天重复试用同一只qEV分离柱得到的不同组分。两次qEV分离 第二批次即第3-第4ml的蛋白浓度相对稳定，在10ug左右。两次隔夜试用同一只qEV柱得到的结果相对稳定，一定程度上说明qEV可以重复多次使用。（前后两次4-4.5ml组分蛋白定量有差别是因为第二次收的时候由于操作失误而多收了几十微升，可能收到了杂蛋白。）
分离得到的不同组分用ALIX和TSG101 两个marker检测外泌体，确定其所在的组分位置。每个样品上样量为1.5ug，从结果看，超速离心得到了exosomes（第二个超速离心泳道的样品是经过多次冻融并放在-30℃保存半年的样品，可见低温保存对exosomes可能不能起到保护作用，冻到-80可能会好一些）。qEV分离得到的不同组分，exosomes确实主要存在于3-4ml的洗脱组分中。分离得到的exosomes应该比较纯净。前后两次隔夜使用同一只qEV柱的结果重复性很好，说明qEV在重复使用方面还是可以的。 （TSG101 ：abcam Catalog# 5377-1 ， ALIX ：CST catalog# #2171 ）
使用qNano检测粒子直径分布情况，将qEV分离柱分离得到的exosome与超速离心的exosome做对比。从两张图可以看到qEV分离得到的exosome粒子直径分布于超速离心基本一致。粒子直径主要分布在100nm左右。(电镜图请见本帖 32楼，有中山大学的同学提供的qEV分离exosome后电镜鉴定的图片。)
以上数据看来，qEV的分离效果跟超离分离法可以媲美。确实可以拿到高质量的exosomes。现在我们对比一下工作时间：
培养细胞、收上清、去除死细胞等操作相同。其余步骤，超速离心需要一轮超离浓缩培液，一轮收exosomes，两轮PBS清洗，每次中间约30-40分钟的操作时间，超速离心管的清洗灭菌时间。超速加减速15min，超速70min，中间处理按照35min计算，清洗灭菌按照30min计算。合计约8.5小时。 qEV分离 培液浓缩需要约5柱平衡10min，分离5min，柱平衡加柱回收15min，样品浓缩收集5min。合计约55min。 由此可见qEV分离确实可以节省不少时间，同时得到很优质的exosomes组分。 对比超速离心和qEV分离，同样50ml培液，超速离心收到约15ugexosomes（与我之前结果持平，比较稳定），而qEV收到约20ug，可见在超速离心的时候会有不少损失。qEV也存在一定的弱点，在4-4.5ml的洗脱组分里也同样存在着少量的exosomes（从WB鉴定可以看出）。但是无伤大雅。
目前我还没有尝试用qEV分离血清样本中的exosomes，有相关数据后再分享给大家。
超离和qEV对比，超离的优势在于省钱，因为qEV要买柱子。但考虑到qEV分离柱可以一定程度的重复使用几次，相信其成本还是不会太高的。
总体看，qEV分离柱的分离效果还是十分不错的。 值得推荐，可以考虑替代超离。
我的protocol 附于此，供目前有试用装的同学尝试，没有试用装又想尝试的同学先不要着急，听Izon的意思，该产品大概在两三个月后就可以在国内买到了。
需要准备的材料有：0.2um滤器过滤过的PBS 50ml、15ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管，15ml超滤管、2ml超滤管等。
protocol：
1、培液2000g 离心10min 取上清到新离心管，
2、10000g 离心30min 取上清到新离心管，
3、超滤管（cat#UFC910008 merck miloppor）5000rpm，10min 浓缩50倍，
4、参考qEV说明书，使用PBS作为洗脱液进行exosomes的分离。
5、第3-第4ml的1ml洗脱液，使用2ml超滤管浓缩至200ul。即exosomes 的PBS溶液。
qEV操作方法：需要准备的材料有 timer、0.2um滤器过滤过的PBS 50ml、15ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管、NaN3低浓度溶液（有毒性，小心操作）。
1、垂直夹住qEV柱子，小心打开上盖，避免内外气压变化过大而毁坏柱子。
2、15ml离心管置于qEV柱下方作为大收集管，打开qEV柱子下盖。（柱子的上盖和下盖不要扔，需要用的）timer开始记录时间，并观察液滴开始滴到收集管内。注意从柱子上方补充PBS，柱子上方PBS存量不要超过2ml。记录收集管内收集5ml洗脱液的时间。当收集管内有10mlPBS时，可认为柱平衡结束，取柱子下盖，内冲PBS赶走气泡。待柱子上方PBS液面接近柱材上缘时使用柱子下盖封闭柱子下方出口，将500ul浓缩的培液样本轻轻上样到柱子内。
3、下方收集管换成5ml离心管，去除柱子下盖，开始洗脱。待样品液面上缘即将进入柱子时加入PBS继续洗脱（千万不要让柱材干掉。进入气泡后柱子就废了）。时刻注意补充洗脱液，当下方收集管内液体到达3ml时，迅速换1.5ml离心管作为收集管，收集1ml洗脱液（该1ml洗脱液即为exosomes 的PBS溶液），在用1.5ml管收集0.5ml备用（这0.5ml里面还有一点点exosomes，但会有一些杂蛋白）。之后换15ml管作为收集管，收集废液，使用约3-4ml PBS清洗qEV柱（一般可以将培液的红色全部洗去）。用8ml含有NaN3的PBS（或一定浓度的酒精溶液）清洗回收qEV柱（NaN3主要用于防菌），使用timer记录收集管内收集5ml洗脱液的时间（用于与之前对比，评判柱子的性能），再加入2mlPBS保持柱材上方存有液体，先盖上盖再该下盖，将qEV柱竖直存放在4°待下次使用。
ps：不同细胞系的培液浓缩倍数可能需要进行调整。qEV柱子在不同温度下洗脱速度不一样，建议柱子拿出来恢复至常温后使用。柱子反复使用的时候注意一次使用完后要用大量的PBS冲洗柱子，建议使用20mlPBS过柱冲洗。
超速离心 protocol：
1、收集细胞培养液，2000g 10min 去除死细胞，取上清 2、10000g 30min 去除细胞残片，取上清 3、110000g 70min 超速离心，取沉淀。PBS重悬沉淀，冲洗沉淀。 4、110000g 70min 超速离心，去沉淀。 5、重复步骤4一次。 6、200ul PBS重悬沉淀即可。
欢迎大家交流讨论提意见。
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|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2015-9-28 22:45:52
收藏
发表于 2015-9-29 10:13:35
发表于 2015-9-29 10:58:18
怒赞！
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