外泌体测不出浓度怎么办？

毛毛 · 发表于 2015-11-19 16:50:07

超速离心提取的HEK293细胞外泌体，用CD63做western检测，条带很清晰，但是用BCA试剂盒或者OD280测浓度都显示为零或负值，外泌体用RIPA（强效）裂解后再测，还是测不出来，大家有过这样的经历吗？求指点！

毛毛 · 发表于 2015-12-14 13:29:31

子非鱼发表于 2015-12-11 21:29
我看最近的一篇文献，exosome提出来直接就去测浓度了，而且做HPLC-MS貌似都是直接做的，不经过提蛋白，看 ...

我没有找到裂解exosome再测浓度的文献，exosome表面有很多膜蛋白包裹，我觉得可以直接测，贴壁细胞分泌的量比较少，可能要用灵敏度高，测定范围微量的试剂盒，血清的就比较多，普通的蛋白浓度试剂盒都可以。

毛毛 · 发表于 2015-11-24 21:59:32

感谢各位战友的热心帮助，浓度问题已解决，是由于外泌体浓度较低，超出了BCA试剂盒的检测范围，换成灵敏度更高的试剂盒就好了。希望能对遇到类似问题的战友有所帮助。

zqy2002 · 发表于 2015-11-19 19:47:38

对照组调零有差错吧

kasangzc · 发表于 2015-11-20 09:06:36

你做WB的时候外泌体直接上样不先进行裂解吗？

毛毛 · 发表于 2015-11-20 13:35:27

kasangzc 发表于 2015-11-20 09:06
你做WB的时候外泌体直接上样不先进行裂解吗？

做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。

毛毛 · 发表于 2015-11-20 13:37:07

zqy2002 发表于 2015-11-19 19:47
对照组调零有差错吧

对照组调零应该没有问题。

kasangzc · 发表于 2015-11-20 16:47:14

毛毛发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

还原还是非还原呢？

zqy2002 · 发表于 2015-11-20 23:42:39

毛毛发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

同意，不需要裂解

zqy2002 · 发表于 2015-11-20 23:44:54

毛毛发表于 2015-11-20 13:37
对照组调零应该没有问题。

既然BCA测试都出现负数了，你说应不应该对照组出错。否则你用水测试一下看是不是负值。

子非鱼 · 发表于 2015-12-11 21:29:13

毛毛发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

我看最近的一篇文献，exosome提出来直接就去测浓度了，而且做HPLC-MS貌似都是直接做的，不经过提蛋白，看你这也是这么直接，难道真的可以？请问，你这个步骤有没有文献支持啊？求分享~~

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