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标题: PKH26和PKH67标记 [打印本页]

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作者: yuantingdong    时间: 2016-9-30 15:35
标题: PKH26和PKH67标记
请教各位大神几个问题。（1）PKH26和PKH67标记有什么区别？是不是都可以用来标记外泌体？   （2）我看PKH67标记步骤里面有一个BSA 终止染色，这个BSA和配抗体稀释液以及免疫荧光BSA封闭液的BSA相同吗？     （3）PKH67标记步骤中，标记后为什么还要重提外泌体呢？谢谢！       另附一张PKH67标记步骤，大家帮我看看有没有问题，三克油！

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作者: 惜名    时间: 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提，是因为你你的外泌体被稀释在了“标记液”中，如果你后面做摄取试验，这些标记液被你加到培养基里，不合适吧？

这个步骤没问题。
根据我做了很多次的经验，Diluent C可以少加一些，0.3-0.5ml足以（如果你是土豪，当我没说），相应的，你的PBS-EXO最好能控制在100ul左右。个人经验，供参考~

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作者: yuantingdong    时间: 2016-10-6 09:27

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

谢谢惜名兄！解答得很详细

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作者: 微泡biomarker    时间: 2016-10-9 10:37

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

想向大神问一下，这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗，肉眼可见吗？谢谢

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作者: 惜名    时间: 2016-10-13 18:32

微泡biomarker 发表于 2016-10-9 10:37
想向大神问一下，这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗，肉眼可见吗？谢谢 ...

PKH26/67原液，肉眼是能看到颜色的，分别是绿色和红色（在荧光显微镜下则分别是红色和绿色）。你染完exo，提纯后，再重悬，是看不到颜色的，因为量太少了。如果能看到，说明你肯定有了PHK原液的较多残留。PKH流式也可以做，但貌似比较麻烦一点，最常规的是做荧光显微镜或共聚焦。

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作者: yuantingdong    时间: 2016-10-17 09:54

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

请教惜名兄，我用的SBI试剂盒提取外泌体，提取出来后，如果做电镜，需要用多少体积PBS溶解外泌体？另外，如果提取RNA是不是直接加trizol，如果提取蛋白质就直接加蛋白裂解液？谢谢

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作者: 惜名    时间: 2016-10-18 17:24

yuantingdong 发表于 2016-10-17 09:54
请教惜名兄，我用的SBI试剂盒提取外泌体，提取出来后，如果做电镜，需要用多少体积PBS溶解外泌体？另外， ...

1、加多少PBS,你自己要摸索的；2、是的，直接加trizol或ripa

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作者: yuantingdong    时间: 2016-10-19 08:34

惜名 发表于 2016-10-18 17:24
1、加多少PBS,你自己要摸索的；2、是的，直接加trizol或ripa

好的，谢谢惜名兄！还请教你一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这样，在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来？谢谢！

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作者: 惜名    时间: 2016-10-21 17:20

yuantingdong 发表于 2016-10-19 08:34
好的，谢谢惜名兄！还请教你一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这 ...

如果你再次从PBS里分离exo，就要再次超离了。。。所以，你可以把沉淀直接保存在-80度，不要重悬。或者重悬以后，直接加buffer煮沸跑WB，不用提纯、裂解了。用PBS的exo直接跑exo也是可以的

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作者: yuantingdong    时间: 2016-10-21 20:42

惜名 发表于 2016-10-21 17:20
如果你再次从PBS里分离exo，就要再次超离了。。。所以，你可以把沉淀直接保存在-80度，不要重悬。或者重 ...

谢谢惜名兄，I see

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作者: 张无忌123    时间: 2016-10-26 12:19
请教下你是用的是百分之多少的BSA呢？有没有试过这样做后与细胞条件培养，看看能不能进入细胞？

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作者: bkpdxpy    时间: 2016-10-30 23:00
我想问一下，为什么都用pkh系列的染料，都是标记膜的。为啥不用Dii，Dio系列的呢？

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作者: ytxing    时间: 2016-12-18 05:37
您好，想向您请教一下，PKH26只只能染细胞膜吗？因为我看说明说PKH26是亲脂性的染料，它会不会对胞浆中的尚未分泌的外泌体进行染色呢？谢谢您。

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作者: Aurorachen    时间: 2017-1-17 13:34
请问可以将染色后的EXO注入小鼠体内，处死制成冰冻切片，免疫荧光观察吗？

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作者: 五月灼蓁    时间: 2017-5-19 00:32

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

请问下大神，Diluent C具体是什么成分，能自己配吗

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作者: sunli    时间: 2017-10-12 21:43
染色后BSA终止，请问BSA的浓度多大？谢谢

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作者: sunluyso014488    时间: 2017-10-22 19:53

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

您好~请问您有PKH67标记外泌体的具体步骤吗，还有BSA的浓度应该调节为多少？？最后利用SBI试剂盒重提外泌体应该加入多少的试剂呢？？最近在查各种资料，希望得到您的帮助，谢谢您！！

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作者: sunluyso014488    时间: 2017-10-23 08:28

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

惜命君您好，可否请教一下，看了一下帖子，整理了大概的实验操作步骤：1.SBI试剂盒提取外泌体，PBS重悬，最好控制在100ul;2.PBS-EXO加入100ul C 液混匀；3.0.4ul PKH26/PKH67加入100ul C液混匀；4.将步骤3加入步骤2中室温孵育4min；5.200ul BSA终止染色；6.SBI试剂盒重提EXO，最好控制在0.6~1ml，加入1/5的SBI试剂，4度静置40~60min,然后12000rpm,4min离心。麻烦您帮忙看一下这样的操作步骤哪里需要修改的地方，谢谢您的指导~~

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作者: 崔雪娇123    时间: 2017-10-31 19:49

惜名 发表于 2016-10-13 18:32
PKH26/67原液，肉眼是能看到颜色的，分别是绿色和红色（在荧光显微镜下则分别是红色和绿色）。你染完exo ...

大神，我想做PKH67的流式，想知道与荧光有什么不同，谢谢你。

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作者: 纪南方    时间: 2017-11-1 12:32

惜名 发表于 2016-10-13 18:32
PKH26/67原液，肉眼是能看到颜色的，分别是绿色和红色（在荧光显微镜下则分别是红色和绿色）。你染完exo ...

请教大神，我们实验室的倒置显微镜型号是尼康T-S DS-R，装了荧光灯，我不知道这个能不能用来看PKH67标记以后的荧光，不知道具体还要些什么参数

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作者: Dr.yu    时间: 2017-11-19 10:00
学习学习

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作者: LJ123    时间: 2018-6-14 21:54
麻烦问一下楼主，PKH67\PKH26是买的哪个公司的？荧光显微镜和共聚焦的图片差异大不？麻烦解答一下，十分感谢啊

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作者: rcg0516    时间: 2018-7-2 19:21
大家用的sigma的哪一款啊？有吞噬细胞型的，还有细胞膜型的

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作者: 弹珠1253    时间: 2018-7-19 15:34

rcg0516 发表于 2018-7-2 19:21
大家用的sigma的哪一款啊？有吞噬细胞型的，还有细胞膜型的

我买的是SIGMA的细胞膜的，因为看到很多exosome相关的参考文献，货号MINI67，下周准备做下这个实验

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作者: walter    时间: 2018-7-25 22:21

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

终止反应的BSA浓度是多少呢？

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作者: beonlyjk    时间: 2018-10-18 12:18

惜名 发表于 2016-10-13 18:32
PKH26/67原液，肉眼是能看到颜色的，分别是绿色和红色（在荧光显微镜下则分别是红色和绿色）。你染完exo ...

惜名兄，如果染色后重提的外泌体应该看不到颜色，那么按照30ug/100ul的外泌体量，超离后能看到沉淀吗？
（我是用PKH26染色外泌体，具体步骤和楼主基本相近，但是最终超离重提后都会看到明显的红色沉淀。我也尝试过将燃料的量降低到1ul，可是这样的话超离重提后就看不到沉淀了）

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作者: z6234206    时间: 2018-12-7 13:10

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

惜名大师，我想问一下，可否外提提完两三天后，再取100ul外泌体做染色？

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作者: rcg0516    时间: 2019-2-21 11:55

z6234206 发表于 2018-12-7 13:10
惜名大师，我想问一下，可否外提提完两三天后，再取100ul外泌体做染色？

我也想问呢，这样做可不可以呢？

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作者: rcg0516    时间: 2019-3-15 11:00
大神，我想问一下，染完色的外泌体能不能负八十冻存呢？

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作者: 阿赵    时间: 2019-5-22 19:42

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

请问这个BSA应该用多少浓度呀？

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作者: 今年要发文章啦    时间: 2019-7-19 14:19
重提用超离的方法怎么做呢

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作者: weixiao    时间: 2020-6-29 16:40

惜名 发表于 2016-10-21 17:20
如果你再次从PBS里分离exo，就要再次超离了。。。所以，你可以把沉淀直接保存在-80度，不要重悬。或者重 ...

你好，我想问下，如果是这样的话，那么外泌体就没有经过蛋白定量，那么如何确定蛋白上样量了？

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作者: 小李同学    时间: 2022-3-5 14:53

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

大神好，请问小动物活体成像仪观察的话需要用什么染色外泌体呢

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