外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 想统计下大家用超速离心时一次用多少量的细胞上清才够用 [打印本页]

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作者: Johnny    时间: 2015-4-20 15:23
标题: 想统计下大家用超速离心时一次用多少量的细胞上清才够用
想统计下大家用超速离心时一次用多少量的细胞上清才够用呢？ 希望大家客观选择，就不设置投票后结果可见了

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作者: yy8651    时间: 2015-4-20 19:29
不知道试剂盒的做的怎么样

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作者: luckkit    时间: 2015-4-21 13:35
偶觉得还少了两个参数，细胞类型和数量

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作者: woshiyywlly    时间: 2015-4-21 13:48
对照和实验组各16个dish

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作者: Johnny    时间: 2015-4-22 10:10

woshiyywlly 发表于 2015-4-21 13:48
对照和实验组各16个dish

16个 10cm dish？

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作者: woshiyywlly    时间: 2015-4-22 15:35

Johnny 发表于 2015-4-22 10:10
16个 10cm dish？

是的，最近嫌dish太多麻烦，换成了225cm^2的flask，一个flask可以抵3个dish

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作者: Johnny    时间: 2015-4-22 17:28

luckkit 发表于 2015-4-21 13:35
偶觉得还少了两个参数，细胞类型和数量

嗯嗯，是的。细胞类型和数量影响也蛮大的

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作者: luckkit    时间: 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10min，有什么影响吗？

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作者: Johnny    时间: 2015-4-24 13:34

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

没设计实验比较过，但个人觉得影响不大

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作者: 木瓜31    时间: 2015-5-7 21:37
那一般多少量细胞上清超离够做电镜鉴定呢？

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作者: 木瓜31    时间: 2015-5-7 21:43

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

300g pellet=cell,2000g pellet=dead cell.个人感觉先以较低速度把细胞离下比较合理，也许直接上2000g细胞应激下会分泌外泌体？ 谁知道呢。。

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作者: bobo    时间: 2015-5-20 23:24

woshiyywlly 发表于 2015-4-21 13:48
对照和实验组各16个dish

实验组和对照组怎么设置啊？

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作者: ashey    时间: 2015-5-21 08:30

木瓜31 发表于 2015-5-7 21:43
300g pellet=cell,2000g pellet=dead cell.个人感觉先以较低速度把细胞离下比较合理，也许直接上2000g细 ...

可以再了解一下各个离心条件下离出来的沉淀和上清分别是什么。

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作者: 木瓜31    时间: 2015-5-25 16:38
D:\桌面陈雅静\外泌体之家\QQ图片20150525163753.png

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作者: 木瓜31    时间: 2015-5-25 16:40

ashey 发表于 2015-5-21 08:30
可以再了解一下各个离心条件下离出来的沉淀和上清分别是什么。

不会发图。。你看看这篇文章吧Isolation and Characterization  of  Exosomes from Cell Culture Supernatants
and Biological Fluids

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作者: bobo    时间: 2015-5-26 10:25

木瓜31 发表于 2015-5-25 16:40
不会发图。。你看看这篇文章吧Isolation and Characterization  of  Exosomes from Cell Culture Superna ...

我想用试剂盒提exosome,那么如何将100ml的细胞培养液浓缩到4ml,从而使培养液中的exosome浓度大些

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作者: woshiyywlly    时间: 2015-5-28 13:56

bobo 发表于 2015-5-20 23:24
实验组和对照组怎么设置啊？

这个要看你实验要求的

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作者: evomicscience    时间: 2015-6-2 12:55

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

the 1st 2000g may damage cell which then release miRNAs and/or proteins etc. You should use 300g to pellet cells,  and then 2000g for apoptotic bodies, 0.22um or 10k for microvesicle.

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作者: seallin    时间: 2015-6-2 13:27

evomicscience 发表于 2015-6-2 12:55
the 1st 2000g may damage cell which then release miRNAs and/or proteins etc. You should use 300g t ...

What is "0.22um or 10k for microvesicle" mean? 0.22 is the flow-through? And 10K is for concentration?

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作者: seallin    时间: 2015-6-2 13:28

evomicscience 发表于 2015-6-2 12:55
the 1st 2000g may damage cell which then release miRNAs and/or proteins etc. You should use 300g t ...

What is "0.22um or 10k for microvesicle" mean? 0.22 is the flow-through? And 10K is for concentration?

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作者: CAAS    时间: 2015-7-23 14:47
200ml，life 的exosome 提取试剂

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作者: yy8651    时间: 2015-7-25 13:40
关于这个量目前还没有比较一致的数据，大家的量看起来很分散

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作者: 虚实高低    时间: 2015-8-14 09:29

luckkit 发表于 2015-4-21 13:35
偶觉得还少了两个参数，细胞类型和数量

还有时间

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作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-18 10:38

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

请教一下，0.22um过滤的目的是什么？

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作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-18 10:39

Johnny 发表于 2015-4-24 13:34
没设计实验比较过，但个人觉得影响不大

请教一下，0.22um过滤的目的是什么？

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作者: 菲奇yyy    时间: 2015-9-12 22:00
至少50超离吧

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作者: meme    时间: 2015-10-20 10:44
我想问一下，可以这次的细胞上清，4℃保存，和下次的细胞上清混合在一起超离吗？

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作者: 熊胖    时间: 2015-10-20 11:35
跟细胞状态也有关吧 有时候8ml超离也肉眼可见

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作者: 习玉峰    时间: 2015-10-27 20:23
200ml的上清，先超速离心，再用试剂盒法提取exosomes，可以吗

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作者: wangxw    时间: 2015-11-8 18:01

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-18 10:38
请教一下，0.22um过滤的目的是什么？

滤掉直径过大的微泡及其他干扰物

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作者: wangxw    时间: 2015-11-8 18:02

习玉峰 发表于 2015-10-27 20:23
200ml的上清，先超速离心，再用试剂盒法提取exosomes，可以吗

什么试剂盒？原理是什么？

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作者: 306    时间: 2016-1-12 09:07
新手，先围观学习

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作者: 千夏的失火夏天    时间: 2016-4-10 14:53
已经超速离心了，还需要试剂盒么？如果用试剂盒的话，就不需要太大的转速，可以把细胞碎片什么的去除就好了

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作者: maitian08    时间: 2016-4-11 10:30
要的细胞量太大了。。。

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作者: wwddwin79    时间: 2016-4-11 11:05
新手想来看看

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作者: sakura_lan    时间: 2016-4-26 14:23
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: Johnny    时间: 2016-4-26 15:12

sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:23
2个10ml的dish可以做的出来吗？

2个10ml的dish, 很悬，相当悬

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作者: Julie_1991    时间: 2016-4-26 20:03
35ML/管，每次2~8管。

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作者: 外小白    时间: 2016-5-6 10:35

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-18 10:39
请教一下，0.22um过滤的目的是什么？

在超速离心后，去除一些大颗粒物质吧，一般说外泌体尺寸不是100nm左右嘛

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作者: sakura_lan    时间: 2016-5-10 11:48
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: lxblqy    时间: 2016-5-23 20:30
30mL试过，能有肉眼可见的沉淀；然而增加到120mL时仍只有少量沉淀，感觉没有比30mL增加多少。不过还没做过定量试验。

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作者: exo    时间: 2016-5-24 10:57

Julie_1991 发表于 2016-4-26 20:03
35ML/管，每次2~8管。

能肉眼可见吗

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作者: Julie_1991    时间: 2016-5-25 19:50
35ML可见。我还离过9ML，肉眼观无明显变化。

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作者: Johnny    时间: 2016-5-26 11:07

Julie_1991 发表于 2016-5-25 19:50
35ML可见。我还离过9ML，肉眼观无明显变化。

什么细胞的上清？

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作者: Julie_1991    时间: 2016-5-31 16:06
气道上皮细胞

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作者: arrowleeincmu    时间: 2016-6-12 15:53
同问各路大神老师，一般多少细胞上清够做电镜？25ml?

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作者: stones    时间: 2016-6-29 22:08

CAAS 发表于 2015-7-23 14:47
200ml，life 的exosome 提取试剂

那你提一次要2瓶life的试剂，6000+哇。。。感觉经费像水一样留。

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作者: hbxghjh    时间: 2016-7-1 14:56
做电镜一点点重悬液就好

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作者: vincent    时间: 2016-7-10 16:29

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

个人觉得应该首先合适离心力完整较少破坏的分离出细胞，再加大离心力分离碎片。一开始就介入大离心力导致细胞破裂。细胞内的复杂物质释放增加。可能会影响后续试验。

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作者: vincent    时间: 2016-7-10 16:31

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-18 10:38
请教一下，0.22um过滤的目的是什么？

去除大的非exosome的囊泡。纯化作用

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作者: 王小坤    时间: 2016-8-19 09:54
新手，路过，顺带膜拜一下。现在在各方面了解一下，准备开一个exosome相关的课题，希望各位前辈们多多指导。

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作者: hengheng37    时间: 2016-8-23 20:11
楼主，我想问一下如果是血浆或血清，超离至少需要多少ml呢

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作者: sonja_forever    时间: 2016-8-26 12:37
请教楼主，细胞培养上清在分离外泌体之前可以暂存在-20度吗

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作者: alidelong    时间: 2016-8-26 17:26
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: Johnny    时间: 2016-8-27 16:44

alidelong 发表于 2016-8-26 17:26
个人觉得与细胞培养时间，细胞培养体积、细胞培养密度、细胞类型等都有因素，在100mL 左右比较合适 ...

赞同~~~~~~~~~~

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作者: Johnny    时间: 2016-8-27 16:45

sonja_forever 发表于 2016-8-26 12:37
请教楼主，细胞培养上清在分离外泌体之前可以暂存在-20度吗

细胞上清不能冻存提取外泌体

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作者: Johnny    时间: 2016-8-27 16:45

hengheng37 发表于 2016-8-23 20:11
楼主，我想问一下如果是血浆或血清，超离至少需要多少ml呢

不做血的，从paper看 最少有250微升的

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作者: 曲直非也    时间: 2016-9-2 15:17
楼主大大，上清如果冻存了，就提不到了还是说质量不好？但我每次收集的上清没有多少啊

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作者: Johnny    时间: 2016-9-2 15:42

曲直非也 发表于 2016-9-2 15:17
楼主大大，上清如果冻存了，就提不到了还是说质量不好？但我每次收集的上清没有多少啊
...

得率会非常少

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作者: dlwlrma    时间: 2016-9-29 18:19
看到大家有的是35ml，有的是100ml，而且上清还不能冻存后提，那岂不是每次都要养很多皿细胞？初学者，还未做过，觉得不是特别方便操作啊

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作者: 中义    时间: 2016-9-30 15:07
如果不考虑成本，越多越好用吧，后续试验就容许失误几次。一般我都是收70ti满负荷量180ml左右离心提取。

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作者: zhaoyun0929    时间: 2016-10-26 08:42
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: 君扬2009    时间: 2016-10-26 08:52
想问一下一下做血浆或血清的话，一般需要多少微升的量？？？做血浆或血清的人多吗？可以加QQ930036343互相学习一下

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作者: xiaodoudou    时间: 2016-11-11 18:45

木瓜31 发表于 2015-5-7 21:37
那一般多少量细胞上清超离够做电镜鉴定呢？

电镜用量很少的，70ML差不多，太少的话外泌体不容易提取出来。

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作者: july    时间: 2016-11-22 21:47
原来这么多人用50-100 的！

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作者: flytohd    时间: 2016-12-23 10:55
新手前来学习

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作者: 白色公子    时间: 2017-1-9 20:43
我们超离一次只能离30ml

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作者: yanyiyun    时间: 2017-2-21 21:06
我用的是60ml,但WB没有检测出来

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作者: zyjjxb    时间: 2017-3-19 13:08
我用的是25ml，基本没问题 肿瘤细胞

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作者: lmmlyb    时间: 2017-3-24 13:30
细胞最少的一次用了36ml，可以看到明显的外泌体沉淀。和细胞类型关系很大，以前用的MCF-7细胞量很少。

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作者: lmmlyb    时间: 2017-3-24 13:32

君扬2009 发表于 2016-10-26 08:52
想问一下一下做血浆或血清的话，一般需要多少微升的量？？？做血浆或血清的人多吗？可以加QQ930036343互相 ...

血清最少我做过10mi，可以得到外泌体。不过只是尝试了一下，主要做细胞。

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作者: 大鹏子    时间: 2017-4-20 10:03
最近做hepG2的外泌体，160mL培养基上清离心下来都看不到沉淀

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作者: xiapqunqun    时间: 2017-4-20 15:30

lmmlyb 发表于 2017-3-24 13:30
细胞最少的一次用了36ml，可以看到明显的外泌体沉淀。和细胞类型关系很大，以前用的MCF-7细胞量很少。 ...

请问你能看到明显沉淀是哪个细胞呀，我提231细胞120ML超离什么都没有？是我操作的问题吗？

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作者: lmmlyb    时间: 2017-4-25 16:15

xiapqunqun 发表于 2017-4-20 15:30
请问你能看到明显沉淀是哪个细胞呀，我提231细胞120ML超离什么都没有？是我操作的问题吗？ ...

HepG2 细胞

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作者: lmmlyb    时间: 2017-4-25 16:16

xiapqunqun 发表于 2017-4-20 15:30
请问你能看到明显沉淀是哪个细胞呀，我提231细胞120ML超离什么都没有？是我操作的问题吗？ ...

231和MCF-7提取效率差不多啊。120ml可以看到沉淀的

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作者: lmmlyb    时间: 2017-4-25 16:18

大鹏子 发表于 2017-4-20 10:03
最近做hepG2的外泌体，160mL培养基上清离心下来都看不到沉淀

我用HepG2做的，量挺大的。

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作者: lczyld    时间: 2017-5-14 22:41
学习XUEIZ XUEXIX  

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作者: lxy_712    时间: 2017-5-15 10:38
新手，来学习一下

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作者: kellyqhqh2002    时间: 2017-5-26 14:42
用试剂盒提取出的外泌体够用吗？我们的合作伙伴是用超离的方法，每次用6个离心管，每个离心管大概30ml。他们认为试剂盒提取的外泌体只够鉴定用，后续共培养、动物实验，那是根本不够的

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作者: husthuagai    时间: 2017-6-29 19:01
我是用100的

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作者: 袁婉雯123    时间: 2017-7-12 10:22

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

想请教下，用超高速离心法提取外泌体，最后一步转速达到100000 g，而且离心70min，能够离心机受得住吗，这么长的工作时间。实验小白，最近要做外泌体，请多多指教！

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作者: wqw131343    时间: 2017-7-18 14:32
试剂盒的效果是不是不好，我几次都没有看到外泌体

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作者: yubeyond    时间: 2017-7-24 15:42
就是超离太耗时间了，提出来的效果还挺好的。

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作者: chrismoring    时间: 2017-8-3 13:07
新手，亟需学习，膜拜大神

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作者: doctorguotie    时间: 2017-8-7 15:59
请问一下各位，"pelleting"这个单词翻译成中文什么词语更专业？

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作者: 牛牛    时间: 2017-8-8 16:20
请问大家你们的胞外囊泡通常保存在什么溶液中、什么温度下呢？

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作者: 牛牛    时间: 2017-8-8 16:21
请问大家你们的胞外囊泡通常保存在什么溶液中、什么温度下呢？

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作者: 牛牛    时间: 2017-8-8 16:24
有没有小伙伴是做微囊泡（100-1000nm）的啊？求交流~

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作者: 记不住名字    时间: 2017-9-7 18:09
A549细胞算是分泌外泌体多的吗？

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作者: wzttray    时间: 2017-9-11 09:49
我一般都是用超速离心机，每次至少500ml，但是不知道为什么有时候能提取出来，有时候不能，感觉不稳定

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作者: 丫丫    时间: 2017-9-13 16:20

Johnny 发表于 2016-8-27 16:45
细胞上清不能冻存提取外泌体

请问细胞上清不能冻存提取外泌体仅仅是因为得率少吗？还是说冻存会有什么影响？

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作者: 故人老    时间: 2017-9-29 18:24

kellyqhqh2002 发表于 2017-5-26 14:42
用试剂盒提取出的外泌体够用吗？我们的合作伙伴是用超离的方法，每次用6个离心管，每个离心管大概30ml。他 ...

我想问问肉眼可以看见管壁的沉淀物吗?

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作者: lc210311    时间: 2017-12-25 20:06


向大神请教下，超离提外泌体时用来洗和重悬的pbs，需要特别处理过的吗？用培源生物的普通pbs行吗？

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作者: peggy4598690    时间: 2017-12-29 12:36

wangxw 发表于 2015-11-8 18:01
滤掉直径过大的微泡及其他干扰物

想请问楼主，0.22um过滤主要在哪个步骤进行? 是第一次超离后，PBS resuspend之后就过滤，然后进行最后一次的超离吗? 这样会不会损失很多外泌体? 感激不尽!

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作者: wchuanlin    时间: 2018-1-11 14:52
刚入门的新手，问一下你们超速离心法从血浆中提外泌体都是参考的那篇文献啊，能给个protocol吗，谢谢

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作者: YOUYOU2017    时间: 2018-2-24 00:04
楼主最好加上细胞类型吧

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作者: yangdudu    时间: 2018-3-6 21:19
楼主是否可以统计超速离心方法需要多少血液？谢谢你。

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作者: 滴哩嘟噜1217    时间: 2018-4-23 13:43
我用的是293T细胞，培养收集培养基，准备超速离心制备外泌体？现目前不解的问题有三：
1、正常培养细胞密度到达80%左右之后，必须得换无外泌体的血清培养基，是否可以直接用OPTI-MEM培养基?
2、我们用的超速离心机是beckman的，一次最多6^38.6ml,收集培养基》200ml，你们一般是怎么保存的呢？
3、电镜分析的时候你们是用的什么电镜呢？对样品制备有什么要求呢？有具体的步骤分享吗？谢谢

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作者: 外泌体怎么ti    时间: 2018-5-7 11:35
这个是不是跟细胞数量有关？

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作者: a969539915    时间: 2018-5-17 15:35

luckkit 发表于 2015-4-24 12:38
另外，请教一下，俺是收集上清后直接2000g 30min,然后0.22um过滤，10e4 30min, 10e5 2hrs, 开始没有300g 10 ...

应该是为了去掉还没死的细胞和细胞碎片，毕竟外泌体也是磷脂双分子层结构跟细胞膜相似，可能会对后期定量造成影响。

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