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标题: 【2017.12.17】This Week in Extracellular Vesicles [打印本页]

作者: hzangs    时间: 2017-12-17 21:07
标题: 【2017.12.17】This Week in Extracellular Vesicles

本周hzangs在最新文献中选取了13篇分享给大家,其中10篇提供中文摘要。第1篇文章介绍了PD-L1+外泌体在头颈部鳞状细胞癌预后的评估作用,文章使用了凝胶排阻层析结合免疫磁珠分离的方式纯化病人血液中的外泌体,由于血清成分复杂,这样的分离方法比较有说服性,同时也是国际细胞外囊泡研究协会比较推荐的“两种分离方法结合”的策略进行分离,大家可以读一读,作参考;第2篇是福建医科大学陈敬华教授发表的又一篇不错的文章,文章介绍了一种外泌体检测和定量方法,陈教授在外泌体的分离鉴定和检测方面还是很有造诣的,大家可以关注一下;第3篇文章介绍了CD9对外泌体释放量的增加作用;第4篇文章介绍了一种工程改造外泌体的方法。其余文章也各有特色,适合不同领域的朋友关注和阅读。相关文章的原文在周一前会发布到论坛同名贴下,需要的可以到论坛下载。


1.   Clinical significance of PD-L1+ exosomes in plasma of Head and Neck Cancer patients. 头颈部肿瘤患者血浆中PD-L1 +外泌体的临床意义。 [Clin Cancer Res] IF=8.74 PMID:29233903

摘要:头颈部鳞状细胞癌(HNSCCs)的微环境具有高度免疫抑制性。表达高水平PD-L1的HNSCC具有特别差的预后。从HNSCC患者的血浆中分离出携带PD-L1并抑制T细胞功能的外泌体。评估了PD-L1 +外泌体对免疫抑制和疾病活性的潜在贡献。我们通过尺寸排阻层析从40个HNSCC患者的血浆分离的外来体使用抗-CD63抗体在微珠进行捕获,对PD-1和PD-L1染色,并通过流式细胞术分析。 PD-L1 +和PD-1 +外泌体/珠复合物的百分比和平均荧光强度(MFI)与患者的临床病理学数据相关。用活化的CD69 +人CD8 + T细胞±PD-1抑制剂孵育PD-L1高或PD-L1low外泌体。测量T细胞上CD69表达水平的变化。通过ELISA测试患者的血浆可溶性PD-L1(sPD-L1)。结果显示外泌体携带的PD-L1水平与患者的疾病活动,UICC分期和淋巴结状态相关(p = 0.0008-0.013)。相反,血浆中sPD-L1或外泌体PD-1水平与任何临床病理学参数都不相关。通过与PD-L1high共孵育而不是PD-L1low外泌体共同孵育CD69表达水平受到抑制(p <0.03)。阻断PD-L1 +外泌体信号传导至PD-1 + T细胞减弱了免疫抑制。因此我们认为,外泌体上的PD-L1水平,但不是sPD-L1的水平,与HNSCC患者的疾病进展相关。循环的PD-L1 +外泌体成为HNSCC患者疾病和免疫活性的有用指标。

PS:这是一篇以头颈部鳞状细胞癌病人血清样本为起始材料进行外泌体研究的报道,文章检测了这些患者血清外泌体中PD-L1的水平与疾病中免疫抑制的相关性,发现只有PD-L1外泌体的丰度与疾病的免疫抑制相关,而游离的sPD-L1和外泌体PD-1与疾病的免疫抑制关系不大。文章使用了凝胶排阻层析结合抗CD63微珠来分离和纯化外泌体用于后续检测,这一做法非常值得学习,这样的操作方式能拿到较为纯净的外泌体,这使得后续研究的可信度大大增加。

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2.  A paper-supported aptasensor based on upconversion luminescence resonance energy transfer for the accessible determination of exosomes. 基于上转换发光共振能量转移的纸支撑传感器用于外泌体的可及测定。 [Biosens Bioelectron] IF=7.48  PMID:29241062

摘要:作为潜在的癌症诊断标志物,外泌体近年来受到广泛的关注。然而,目前仍然缺乏简便的检测和定量外泌体的方法。在这里,我们使用一个简单的纸支持适配器基于发光共振能量转移(LRET)从纳米粒子(UCNPs)到金纳米棒(金NRs)用于外泌体的测定。当外泌体存在时,适配体的两部分可以与外泌体表面上的CD63蛋白结合并封闭UCNP和Au NR之间的距离,从而启动LRET并促进发光猝灭。这些变化可以通过自制的图像系统来监测,并且使用Photoshop软件提取所获得的彩色图像的绿色通道强度以量化发光。因此,UCNPs发光的猝灭与外泌体浓度(1.0×10^4〜1.0×10^8个/μL)呈线性关系,能够检测和定量外泌体。这种方法可以达到的外泌体低检测限为1.1×10…^3个粒子/μL,同时该方法通过使用UCNPs作为发光材料来有效地减少背景信号。这项研究提供了一个有效的和实用的方法来检测exosomes,这一方法有望应用于临床检测。

PS:福建医科大学陈敬华老师近期发表的外泌体检测方法的文章。陈老师也算是深耕外泌体检测方面的国内专家了。去年也曾发表过一篇很好的相关文章,感兴趣的朋友可以关注一下。

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3.  The Impact of the CD9 Tetraspanin on Lentivirus Infectivity and Exosome Secretion. CD9 Tetraspanin对慢病毒感染性和外泌体分泌的影响。 [Mol Ther] IF=6.94  PMID:29221804

摘要:高效的转导工具是研究和治疗发展的标志。在此,我们利用CD9过表达提高细胞外囊泡生产率。大多数人类细胞从它们的表面(微泡)或腔内内体衍生的膜(外泌体)分泌小囊泡。具体而言,四跨膜蛋白CD9的水平增加导致具有四种不同人类细胞系分泌的外泌体样特征的细胞外囊泡的数量显着增加。有趣的是,外泌体及其生物发生途径显示与慢病毒的相似性,并且我们检查了CD9表达对重组慢病毒载体的释放和感染性的影响。虽然释放的病毒颗粒的滴度在高表达CD9细胞中生产后没有增加,但我们观察到在慢病毒基因递送到许多人类细胞系(包括HEK293,HeLa,SH-SY5Y)中的速度和效率方面的性能改善。我们的研究结果表明了CD9对慢病毒载体和外泌体生物发生的重要作用,并指出了这种四跨膜蛋白在膜融合,病毒感染性和外泌体介导的水平信息转移中的显着功能。

PS:之前一直有朋友询问是否有办法增加外泌体的释放量。Hzangs当时并没有看到过相关的文章。现在这样的文章出现了,这篇文章介绍了CD9过表达对外泌体释放量和病毒侵染力的影响,感兴趣的朋友可以读一读。

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4.  Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression. 纳米颗粒的方向来控制RNA加载和细胞外囊泡上的配体显示用于癌症消退。 [Nat Nanotechnol] IF=35.27  PMID:29230043

摘要:纳米技术提供了许多好处,在这里我们报告应用RNA纳米技术进行方向控制的优势。改变箭头状RNA的方向以控制细胞外囊泡膜上的配体展示以用于特异性细胞靶向或调节小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)的细胞内运输。在箭头状RNA尾部放置膜锚定胆固醇使细胞外囊泡的外表面上展示RNA适体或叶酸。相反,将胆固醇置于箭头处导致RNA纳米颗粒部分加载到细胞外囊泡中。利用特定靶向的RNA配体和细胞外囊泡进行有效的膜融合,得到的配体展示胞外囊泡能够将siRNA特异性递送至细胞,并有效地阻断三种癌症模型中的肿瘤生长。展示与前列腺特异性膜抗原结合的适体并且载有生存素siRNA的胞外囊泡抑制了前列腺癌异种移植物。表面生长因子受体适配体的相同的胞外囊泡抑制了原位乳腺癌模型。同样,生存素siRNA加载和叶酸展示细胞外囊泡抑制患者来源的结直肠癌异种移植。

PS:工程学改造细胞外囊泡。主要使用了RNA纳米材料来改变细胞外囊泡的特性和功能。有点复杂,hzangs表示不是很懂……

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5.  Exosomes from MiR-126-Overexpressing Adscs Are Therapeutic in Relieving Acute Myocardial Ischaemic Injury. MiR-126-过表达的脂肪干细胞释放的外泌体在缓解急性心肌缺血损伤中是治疗作用。 [Cell Physiol Biochem] IF=4.65  PMID:29241208

摘要:最近的研究表明,外泌体在脂肪干细胞(ADSC)移植介导的缺血性心脏病治疗中发挥重要作用。但治疗效果不明显。这项研究的目的是调查ADSC衍生的外泌体中富含microRNA(miR)-126对急性心肌梗塞(AMI)是否具有更多的保护作用。通过透射电子显微镜鉴定外泌体形态,并使用纳米颗粒追踪分析进一步检查外泌体颗粒群体特性。建立心肌梗死大鼠模型,建立缺氧诱导的H9c2心肌细胞损伤模型,研究miR-126过表达ADSCs的外泌体的保护机制。体外实验结果显示,在缺氧诱导过程中,来源于miR-126过表达ADSCs的外泌体可以通过减少炎症因子表达而降低H9c2心肌细胞损伤。在低氧条件下,富含miR-126的外泌体也降低了H9c2细胞的纤维化相关蛋白的表达。 Matrigel和Transwell检测显示富含miR-126的外泌体分别显着促进了微血管的生成和迁移。体内研究证实来源于ADSCs的外泌体显着降低了梗塞的心肌损伤区域,特别是在富含miR-126的外泌体处理之后。用富含miR-126的外泌体处理后,心脏纤维化和炎性细胞因子表达也降低,另一方面,在AMI大鼠的梗塞区域促进血管形成。结果表明,miR-126表达增强的ADSC衍生的外泌体可以通过保护心肌细胞免于凋亡,炎症,纤维化同时增加的血管生成来改善心肌损伤。

PS:二军大的老师发表的一篇利用过表达miR-126的脂肪干细胞来源外泌体改善心肌梗塞预后的实验性文章,所有数据基于对心肌梗塞鼠模型和体外实验模型得出。比较前期的研究,结果也不错。分子是外泌体中的miRNA,比较经典的研究思路和方法,值得刚刚进入该领域的朋友学习和借鉴。

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6.  GVHD amelioration by human bone marrow mesenchymal stromal/stem cell-derived extracellular vesicles is associated with peripheral preservation of naive T cell populations. 人骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡对GVHD的改善与对幼稚T细胞群体的调控有关。 [Stem Cells] IF=5.90  PMID:29239062

摘要:急性移植物抗宿主病(aGVHD)患者中相当一部分人对体外培养扩增的人骨髓间充质基质/干细胞(BM-MSC)的细胞治疗有反应。然而,这些细胞可以改善aGVHD相关并发症的机制仍有待研究。我们在这里展示BM-MSC衍生的细胞外囊泡(EVs)能够重现BM-MSC对aGVHD的治疗作用。人类BM-MSC衍生的EVs的全身输注延长了aGVHD小鼠的存活并且减少了多个GVHD靶向器官中的病理损伤。在EV治疗的GVHD小鼠中,CD4 +和CD8 + T细胞被抑制。重要的是,CD62L-CD44 +与CD62L + CD44-T细胞的比例也降低了,表明BM-MSC衍生的EV抑制T细胞从幼稚到效应表型的功能性分化。 BM-MSC衍生的EV也保存了CD4 + CD25 + Foxp3 +调节性T细胞群。在用BM-MSC衍生的EV的CD3 / CD28-刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的培养物中,CD3 + T细胞活化受到抑制。然而,这些细胞在来自正常人真皮成纤维细胞(NHDF)的EVs的培养物中未被抑制。 NHDF衍生的EV没有改善aGVHD在小鼠中的临床或病理特征,表明BM-MSC衍生的EV具有特有的免疫调节功能。如通过GO富集分析所确定的,BM-MSC衍生的EV中的微RNA与NHDF衍生的EV中的微RNA的芯片分析显示miR-125a-3p的上调和细胞增殖过程的下调。总的来说,我们的发现提供了第一个证据,即通过BM-MSC衍生的EV的治疗性输注改善aGVHD与调节循环初始T细胞相关,这一功能可能是由于BM-MSC衍生的EV的独特微RNA组成。

PS:移植物抗宿主病是器官移植等过程中比较容易出现的疾病。而间充质干细胞回输则可以有效改善病症。这篇文章从细胞外囊泡功能的角度解析了间充质干细胞对移植物抗宿主病的缓解机制。

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7.  IL-3R-alpha blockade inhibits tumor endothelial cell-derived extracellular vesicle (EV)-mediated vessel formation by targeting the β-catenin pathway. 阻断IL-3R-α能够通过靶向β-catenin途径来抑制肿瘤内皮细胞衍生的胞外囊泡(EV)介导的血管形成。 [Oncogene] IF=7.93  PMID:29238040

摘要:促血管生成细胞因子白细胞介素-3(IL-3)由乳腺癌和卵巢癌组织微环境中的炎性细胞释放,并且还充当人乳腺癌和肾肿瘤衍生的内皮细胞(TEC)的自分泌因子。我们以前已经表明,通过转移活性分子,IL-3处理的内皮细胞(EC)释放细胞外囊泡(EV),其可作为邻近EC的旁分泌机制。因此,本研究研究了抗IL-3R-α阻断抗体对从TECs释放的EV(抗-IL-3R-EV)促进血管生成作用的影响。我们发现抗IL-3R-EV治疗阻止了新生血管的形成,更重要的是,也诱导了体内TEC衍生的新生血管的消退。当比较天然TEC衍生的EV(EV)和抗IL-3R-EV的miR-内容物时,我们发现在不同水平靶向(Wnt)/β-catenin途径的两个miR被差异化调节。直接靶向β-catenin的miR-214-3p被上调,而靶向APC和GSK3β的miR-24-3p被下调。事实上,当它们转移到细胞中时,检测到“β-catenin破坏复合物”的两个成员的低β-联蛋白含量和高水平。此外,在用抗IL-3R-EVs,pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EV处理的TEC中发现c-myc下调,这与miR-214的网络分析-3p和miR-24-3p基因靶向一致。最后,体内研究已经证明pre-miR-214-3p-EV-和antago-miR-24-3p-EV处理的动物中血管的生长受损。当应用组合治疗时,这些效果变得更加明显。本研究的结果确定了经典的Wnt /β-catenin途径作为TEC衍生的EV促血管生成作用的相关机制。此外,我们在此提供的证据表明IL-3R阻断可能比miR靶向在通过改变TEC-EV-miR货物抑制幼稚TEC衍生的EV的促进血管形成效应方面产生一些显着的优势。

PS:文章关注了肿瘤血管生成过程,之前的研究已经表明IL-3在肿瘤血管生成中的作用,而本文介绍了只用IL-3R阻断剂来抑制该通路后阻断血管生成的表型及机制。机制落脚在miRNA,相对比较清晰明了。

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8.  Extracellular vesicles from human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stromal cells (hiPSC-MSCs) protect against renal ischemia/reperfusion injury via delivering specificity protein (SP1) and transcriptional activating of sphingosine kinase 1 and inhibiting necroptosis. 来自人诱导的多能干细胞衍生的间充质基质细胞(hiPSC-MSC)的胞外囊泡通过递送特异性蛋白质(SP1)和转录激活鞘氨醇激酶1并抑制坏死来保护肾脏缺血/再灌注损伤。 [Cell Death Dis] IF=5.38  PMID:29233979

摘要:肾缺血再灌注是急性肾损伤(AKI)的主要原因,该疾病具有高致死性。在这里,我们研究发现hiPSC-MSC分泌的细胞外囊泡(EV)在保护肾脏I / R损伤中发挥重要作用。 hiPSC-MSCs-EVs可以与肾细胞融合并将SP1递送到靶细胞中,随后激活SK1表达并增加S1P形成。使用染色质免疫沉淀(ChIP)分析和萤光素酶测定来确认SP1直接结合SK1启动子区域并促进启动子活性。此外,在大鼠I / R损伤模式中,SP1抑制(MIT)或SK1抑制(SKI-II)完全消除了hiPSC-MSCs-EVs的肾脏保护作用。然而,necroptosis抑制剂Nec-1的预处理显示与仅施用hiPSC-MSC-EVs没有区别。我们通过CRISPR / Cas9系统产生SP1敲除hiPSC-MSC细胞系,除非在体外和体内通过Ad-SP1恢复SP1的水平,否则SP1敲除不能表现出hiPSC-MSC-EVs的保护作用。总之,本研究描述了hiPSC-MSCs-EVs通过将SP1递送至靶肾细胞和细胞内激活SK1的表达和S1P的产生对肾I / R损伤的抗坏死作用。这些发现提示了肾脏保护免受I / R损伤的新机制,并且指出了用于各种肾脏疾病和肾移植的潜在治疗方法。

PS:文章报道了人诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞来源的细胞外囊泡对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其背后的机制,机制研究相对比较严谨,值得大家参考学习一下。

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9.  Large Cardiac-Muscle Patches Engineered from Human Induced-Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiac Cells Improve Recovery from Myocardial Infarction in Swine. 人类诱导多能干细胞衍生的心脏细胞制作的大型心肌修补物能够改善猪心肌梗塞预后。 [Circulation] IF=17.05  PMID:29233823

摘要:在纤维蛋白支架中通过悬浮心肌细胞,平滑肌细胞和从人诱导多能干细胞分化的内皮细胞,产生临床相关维度(4cm×2cm×1.25mm)的人心脏肌肉片(hCMP) ,然后在动态(摇摆)平台上培养该构建体。体外评估hCMPs表明成熟响应动态培养刺激。体内评估在心肌梗塞(MI)的猪模型中进行。动物组包括:用两种hCMP(MI + hCMP,N = 13)处理的MI心脏,用两种无细胞开放纤维蛋白斑块(MI + OP,n = 14)或者没有实验斑块(MI,n = 15) );第四组动物进行假手术(SHAM,n = 8)。通过磁共振成像评估心脏功能和梗塞面积,通过植入环记录仪评估心律失常发生率,并通过计算人Y染色体表达的定量PCR测量来评估植入率。另外的研究检查了心肌蛋白表达谱变化以及与来自细胞修补物的外泌体有关的可能的作用机制。结果显示HCMP在制造1天内开始同步跳动,经过7天的动态培养刺激后,体外评估显示出与电子机械耦合,钙处理和产生力的改进有关的机制。移植后4周植入率为10.9±1.8%。 hCMP移植可显着改善左心室(LV)功能,梗死面积,心肌壁应力,心肌肥厚,减少周围瘢痕边界区心肌细胞凋亡。 hCMP移植也逆转了肌节蛋白调节蛋白磷酸化中一些MI相关的变化。从hCMP释放的外泌体似乎具有改善心肌细胞存活的细胞保护性质。综合以上结果可知,我们制造了一种临床相关大小的hCMP,来自hiPSC的心脏细胞。动态培养7天后,hCMP体外成熟。这种类型的hCMP的移植导致梗塞面积的显着减小以及与LV壁应力降低相关的心脏功能的改善。 hCMP治疗与致心律失常性的显着变化无关。

PS:这是一篇研究型论文,论文研究了人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞在前临床应用于猪心肌梗塞模型治疗中的作用。其中评价了部分外泌体可能的功能影响。

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10.  Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. 从人肾细胞癌组织分离的胞外囊泡通过azurocidin破坏血管内皮细胞形态。 [Int J Cancer] IF=5.53  PMID:28975613

摘要:癌症相关的细胞外囊泡(EVs)密切参与肿瘤微环境的建立和转移的发生。但以往的研究主要依靠培养的细胞系或小鼠模型进行实验,使人们很难充分认识人体内的EV功能。因此,我们直接从外科手术切除的透明肾细胞癌(ccRCC)组织和相邻的正常肾组织(n = 20)中提取EV。定量LC / MS分析鉴定出3871个组织渗出性EV(Te-EV)蛋白,其中azurocidin(AZU1)在肿瘤Te-EV中高度富集(p = 2.85×10-3,倍数变化= 31.59)。重要的是,ccRCC患者的血清EVs的AZU1含量也显着高于健康供者。我们进一步发现ccRCC衍生的EV对血管内皮细胞层具有AZU1依赖性的膜透化活性。

PS:这篇文章的特色在于是从外科手术去除的病人样本中分离了EV进行了分析,并发现了肾细胞癌来源外泌体中azurocidin对血管通透性的影响。

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11.  Role of extracellular vesicles in glioma progression. 细胞外囊泡在胶质瘤发展中的作用。 [Mol Aspects Med] IF=10.86  PMID:29222067

PS:一篇不错的综述,主要汇总了在胶质瘤发生发展过程中细胞外囊泡的作用。新进入细胞外囊泡领域的朋友可以关注一下,读一读。

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12.  Intercellular Transfer of Microvesicles from Young Mesenchymal Stromal Cells Rejuvenates Aged Murine Hematopoietic Stem Cells. 从年轻的间充质基质细胞来源的微囊泡在细胞间转移用于恢复老年鼠造血干细胞功能。 [Stem Cells] IF=5.90  PMID:29230885

PS:比较炫酷的研究吧。发现了使用年轻间充质基质细胞来源微囊泡可以是老年鼠的造血干细胞复壮,目前在临床应用中,造血干细胞移植通常要考虑供者年龄,而这一发现对未来的临床应用有指导意义。

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13.  Foetoplacental communication via extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. 在正常妊娠和先兆子痫中胎儿胎盘通过细胞外囊泡进行通讯。 [Mol Aspects Med] IF=10.86  PMID:29222068
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PS:一篇综述,主要汇总了目前妊娠过程中胎儿胎盘信息通讯过程中细胞外囊泡的作用。


今天的整理就到这里。希望大家可以有所收获。大家下周见!


作者: 戈多眷恋的人    时间: 2017-12-17 21:36
谢谢分享,非常感谢,感谢楼主
作者: kibana    时间: 2017-12-17 23:44
谢谢。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
作者: yangjw91xy    时间: 2017-12-17 23:58
感谢分享!
作者: mofan    时间: 2017-12-18 08:34
谢谢分享
作者: 步步唧唧    时间: 2017-12-18 08:42
学习学习
作者: 我是外泌体    时间: 2017-12-18 08:52
ganxiefenxinang
作者: lemon8975    时间: 2017-12-18 09:42
谢谢总结分享!
作者: pyhwq    时间: 2017-12-18 10:23
Thank you very much!
作者: hlqp    时间: 2017-12-18 10:32
谢谢分享
作者: ly200101042    时间: 2017-12-18 11:27
感谢每周的分享
作者: wenwen    时间: 2017-12-18 14:14
谢谢楼主的分享
作者: mno    时间: 2017-12-18 16:09
谢谢分享
作者: mazhm131    时间: 2017-12-18 16:31
谢谢群主分享!
作者: 生物小博    时间: 2017-12-18 16:38
很好的文章 可以学习下
作者: cui    时间: 2017-12-18 20:01
谢谢分享 !!!
作者: liyanyan    时间: 2017-12-18 23:23
感谢楼主
作者: cjh_huaxue    时间: 2017-12-18 23:55
谢谢楼主
作者: VTZFLTD    时间: 2017-12-19 00:11
谢谢分享
作者: ceiba    时间: 2017-12-19 08:43
楼主辛苦了~
作者: IrisWang    时间: 2017-12-19 09:03
谢谢分享~~
作者: wangjoseph    时间: 2017-12-19 09:26
谢谢分享!
作者: 墨清    时间: 2017-12-19 12:25
感谢楼主分享
作者: percypercy    时间: 2017-12-19 13:38
谢谢楼主分享
作者: percypercy    时间: 2017-12-19 13:41
感谢楼主分享!
作者: Megan    时间: 2017-12-19 14:14
谢谢楼主
作者: hermmoon    时间: 2017-12-19 15:40
谢谢分享
作者: xiaomuguakeyan    时间: 2017-12-19 17:18
每周打call,辛苦了啦
作者: 西西    时间: 2017-12-19 17:41
我做的凝胶排阻超级慢....要来学习一下了....

作者: tingtingting    时间: 2017-12-19 23:11
谢谢分享
作者: dalianyikedaxue    时间: 2017-12-19 23:16
每周值得学习
作者: Eric91    时间: 2017-12-20 00:46
感谢分享新知识新进展
作者: 哲哲    时间: 2017-12-20 09:07
感谢分享

作者: anyingzhiyi    时间: 2017-12-20 09:25
感谢 很有帮助
作者: 栾珍珠    时间: 2017-12-20 11:36
感谢分享!!!!!!!!!!!
作者: 简草苍苍    时间: 2017-12-20 13:14
好想看看
作者: zlpxiangya    时间: 2017-12-20 20:54
谢谢分享
作者: EV-yyb    时间: 2017-12-21 10:08
谢谢,楼主

作者: Miss神佑    时间: 2017-12-21 12:37
666666666666666666
作者: 故人老    时间: 2017-12-21 15:58
谢谢分享
作者: 萨仁其其格    时间: 2017-12-21 20:02
做研究要趁早啊,加油!
作者: zhangyang0310    时间: 2017-12-22 11:11
谢谢分享
作者: xiu    时间: 2017-12-24 10:15
谢谢分享~~~
作者: jzhou65    时间: 2017-12-24 19:56
谢谢分享,非常感谢,感谢楼主
作者: winqi    时间: 2017-12-25 14:45
谢谢分享!!!!!!!
作者: wangyu2920    时间: 2017-12-25 15:28
感谢分享!
作者: jinzc0228    时间: 2017-12-25 15:53
不错的文章
作者: linzhen41    时间: 2017-12-26 10:38
谢谢分享!
作者: kqzhangni    时间: 2017-12-26 14:19
想看全文,谢谢分享
作者: hlqp    时间: 2017-12-26 15:52
谢谢分享

作者: yali0901    时间: 2017-12-28 19:26
谢谢分享
作者: 墨染荼蘼    时间: 2017-12-30 19:22
学习了!
作者: 叶香辰    时间: 2018-1-4 19:42
谢谢分享!
作者: 白羊    时间: 2018-1-9 13:21
谢谢楼主 赞~
作者: 飞飞飞飞飞    时间: 2018-1-9 16:36
谢谢分享,非常感谢,感谢楼主
作者: Funleeeeee    时间: 2018-1-19 18:00
这个挺有趣
作者: 浅浅123    时间: 2018-1-22 16:51
感谢分享
作者: Joyel    时间: 2018-1-23 00:24
谢谢。。。。。。。。。。。。
作者: CARD    时间: 2018-1-24 10:11
谢谢分享
作者: 外小白    时间: 2018-1-24 16:15
谢谢分享!
作者: TZHANG16    时间: 2018-2-3 17:41
谢谢分享
作者: sunshuli    时间: 2018-2-9 10:40
学习学习
作者: 18862807590    时间: 2018-2-9 12:44
dsssssssssssssssssssss
作者: droyx24    时间: 2018-3-13 15:37
感谢分享
作者: sdnujack    时间: 2018-3-19 09:29
XIEXIEFENXIANG FEICHANGGANXIE
作者: ldl681656    时间: 2018-3-22 21:33
谢谢分享
作者: chenghao66    时间: 2018-3-25 19:05
谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢
作者: xcf201314    时间: 2018-3-26 11:13
感谢分享
作者: msurgeon    时间: 2018-3-26 20:31
非常好的一篇文章
作者: AI15777126378    时间: 2018-3-30 10:35
谢谢楼主
作者: 溪澈冰清    时间: 2018-7-21 09:25
谢谢分享
作者: 鲜于    时间: 2018-10-26 17:06
谢谢老师分享




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