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标题: 如何大规模生产符合GMP要求的临床级外泌体用于癌症治疗？ [打印本页]
作者: Johnny 时间: 2018-4-27 15:12
标题: 如何大规模生产符合GMP要求的临床级外泌体用于癌症治疗？
本帖最后由 Johnny 于 2018-4-27 16:37 编辑
如何大规模生产符合GMP要求的临床级外泌体用于癌症治疗？
在外泌体领域发表了2篇Nature大作的MD安德森癌症中心的Raghu Kalluri博士是外泌体领域大牛之一。
2015年，Kalluri博士在Nature杂志发表外泌体文章，报道了血液循环中的GPC1阳性的外泌体作为早期胰腺癌非侵入式液体活检方案的可能性。随后创立Codiak BioSciences公司，专注研发基于外泌体的诊断与治疗产品。截至目前，Codiak总共募集了总1.685亿美元的投资。
2017年，Kalluri博士又在Nature杂志发表外泌体文章，报道了外泌体作为RNAi的有效载体的可能性。该研究利用成纤维细胞生产外泌体，经电转方法将靶向突变KRAS的siRNA导入外泌体制成iExosome。由于该外泌体本身携带CD47，可减少被循环单核细胞清除。iExosome顺利到达癌细胞后，将siRNA递送到癌细胞中，从而抑制KRAS GTPase活性以及下游的RAF-MEK-ERK或PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活，最终抑制肿瘤的生长和转移。
这是实验室的研究性工作。外泌体治疗癌症的临床转化应用，首先第一步要解决的就是如何生产临床级GMP外泌体。
最近，Kalluri博士在JCI insight杂志上发表文章，阐述了临床级外泌体的生产和质检流程。该研究报告了采用GMP标准的基于生物反应器的大规模临床级外泌体生产方法。建立了标准操作流程以生产具有靶向致癌Kras能力的工程化外泌体（iExosomes）。在多个体外和体内研究中测试了临床级GMP iExosomes，证实了致癌Kras的抑制和几种胰腺癌小鼠模型的存活增加。该研究还探究了这种临床级iExosome的保存期限、体内分布、毒理学特征以及与化学疗法结合的功效，为GMP iExosomes的未来临床试验建立基础。总的来说，该研究阐明了产生用于各种人类疾病治疗的临床级外泌体的过程和可行性。
简要来说，GMP iExosomes的生产就是利用生物反应器来大规模培养细胞。通过生物反应器可定期收获大量的培养上清，每次收集培养上清都进行无菌（确保没有厌氧菌、需氧菌）检测、内毒素（<1 EU/mL）和支原体（PCR，阴性）检测。收集好的上清可以先放-80度冻存。待攒至足量后将上清置于4度过夜解冻，利用超速离心法提取外泌体。1000g 4°C离心15分钟→0.2过滤→100000g离心3小时→得到外泌体沉淀→用CB（clinical buffer）重悬，每100 mL上清的到的外泌体沉淀用4 mL重悬。在分次离心的过程中，外泌体CB溶液会在4度最长保存72小时以将所有外泌体汇总在一起处理。最终得到了72 mL的外泌体CB溶液。取其中的0.5 mL用于纳米颗粒检测、1 mL用于流式检测、0.5 mL用于内毒素检测、1 mL用于无菌检测。剩余69 mL分装2 mL一支，冻存于-80度，或经工程化处理（电穿孔将靶向致癌Kras的siRNA导入）后再分装冻存。
GMP级MSC源外泌体生产
在GMP级MSC源外泌体的生产、鉴定和各项质量控制完成后，在体外和体内验证了其对胰腺癌的治疗作用、以及与化疗药物联合用药时的作用。
GMP级iExosome的体外效用。可以看到GMP级iExosome可显著增加肿瘤细胞凋亡，减少突变KRAS的基因表达。
GMP级iExosome在小鼠体内的效用。GMP级iExosome显著抑制了肿瘤的生长，增加了胰腺癌模型小鼠的存活。
GMP级iExosome与化疗药物吉西他滨（gemcitabine）联合用药的作用。
外泌体在小鼠体内的分布。可以看出，携带肿瘤的小鼠在静脉内给外泌体后，显示出在肿瘤位置的特异性积累。
GMP级iExosomes的稳定性。从图中可以看出，GMP级iExosomes在-80度最长冻存6个月后，其数量（A）、大小（B）、形态（C）、蛋白marker（D）方面无明显下降；在促进肿瘤细胞凋亡方面，冻存对GMP级iExosomes也无明显影响，但是在室温或4度保存超过2天会显著降低其作用效果。
GMP级iExosomes在体内效用上的稳定性。同样可以看出，冻存对GMP级iExosomes的体内效用也无明显影响，但是在室温或4度环境下保存不宜超过2天。总结一下，GMP级iExosomes可在-80度保存6个月，4度或室温条件下保存2天。
该研究报告了从骨髓来源MSC大规模生产符合GMP标准外泌体的方法。提供了详细的操作流程，克服了生产临床用治疗性外泌体存在的几个障碍。制定了符合GMP标准流程的iExosomes大规模生产及质量控制的标准。这些标准包括确定外泌体制剂的尺寸分布、外泌体标志物的分析、和效力测定。该研究报道为外泌体的临床治疗应用奠定了良好的基础。
参考文献：
Mendt, M., et al. (2018). "Generation and testing of clinical-grade exosomes for pancreatic cancer." JCI Insight 3(8).
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作者: 生物小博 时间: 2018-4-27 17:28
很好的文章 可以学习下
作者: 13811359529 时间: 2018-4-28 09:06
学习学习
作者: 生物小博 时间: 2018-4-28 09:28
很好的文章 可以学习下
作者: liubing 时间: 2018-4-28 09:41
请求原文，谢谢
作者: 我是外泌体 时间: 2018-4-28 13:49
感谢感谢
作者: wangjiachen 时间: 2018-4-30 10:33
感谢分享，值得学习
作者: zyting 时间: 2018-5-2 15:56
学习一下
作者: mcydou 时间: 2018-5-4 13:18
谢谢！迫切的想了解外泌体的提取方法
作者: figogo1117 时间: 2018-5-4 14:20
谢谢师兄分享
作者: zhangpuxjtuer 时间: 2018-5-7 21:31
看看啦，不知道能不能买点
作者: zhoushanjian 时间: 2018-5-7 21:35
非常感谢楼主
作者: 芝麻配海带 时间: 2018-5-8 08:31
非常感谢楼主
作者: ffzhao 时间: 2018-6-3 10:21
aaaaaaaaaaaa
作者: 杰然 时间: 2018-6-6 10:42
非常感谢！
作者: 暗红柳绿 时间: 2018-6-6 17:07
文章很好，学习中
作者: gxshen 时间: 2018-6-7 14:00
谢谢，可以看看大牛的文章
作者: sha1900 时间: 2018-6-8 13:49
谢谢分享
作者: dwtou 时间: 2018-6-27 12:55
学习！感谢楼主！
作者: nagnosis 时间: 2018-6-28 10:07
感谢分享
作者: chenshasha_2009 时间: 2018-6-28 10:58
如果实验结果中有和传统胰腺癌药物的对比效果，会不会更能体现iExosome作为体外治疗新方法的可行性呢？
作者: 宓七 时间: 2018-6-30 21:14
感谢谢谢
作者: juanjuanchenpku 时间: 2018-8-31 08:50
谢谢分享
作者: caorong19870118 时间: 2018-9-10 20:45
求原文学习
作者: shanrenzaiye 时间: 2018-10-8 10:36
仔细看看，大牛的东西值得好好学习
作者: shanrenzaiye 时间: 2018-10-19 16:23
非常感谢
作者: trouble 时间: 2018-10-25 16:54
实用，十分感谢！
作者: 15812070975 时间: 2018-10-31 12:01
谢谢分享
作者: exozzz 时间: 2018-11-9 14:32
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作者: pony123 时间: 2018-11-9 23:42
感谢分享感谢分享
作者: 重医陈旭阳 时间: 2018-12-17 22:09
赞赞赞阿娜指南赞赞
作者: shigetao 时间: 2019-1-3 10:38
看下原文
作者: 王建辉 时间: 2019-2-12 16:17
谢谢分享
作者: 魔芋舂 时间: 2019-3-11 15:27
谢谢分享
作者: danizer 时间: 2019-3-12 09:23
ganxiefenxiang
作者: mclarenx 时间: 2019-3-12 22:41
学习一下，十分感谢
作者: bokelu 时间: 2019-3-18 10:57
想学习一下
作者: ci_ao 时间: 2019-3-18 21:10
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作者: bugwr 时间: 2019-6-19 18:38
收藏了，谢谢
作者: sujiachen 时间: 2019-6-21 11:19
谢谢楼主，辛苦了
作者: c4zhufo 时间: 2019-7-8 16:01
谢谢大佬，正好想关注一下这方面的东西
作者: bertrand 时间: 2019-7-29 01:40
多谢！
作者: freezonli 时间: 2019-8-14 10:57
干货！棒棒！
作者: suoweiyiran0411 时间: 2019-8-15 10:45
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作者: 葫芦娃 时间: 2019-8-15 11:44
谢谢分享
作者: MYH-Murf 时间: 2019-10-11 15:31
想要学习下
作者: yujili 时间: 2019-10-11 16:59
谢谢楼主分享！！
作者: a王建辉 时间: 2019-11-15 09:21
谢谢！迫切的想了解外泌体的提取方法
作者: jwz12gz 时间: 2019-12-14 20:12
fei长优秀的文章，值得一读
作者: tongqing123 时间: 2020-1-24 11:41
多谢分享
作者: aq362697851 时间: 2020-3-7 22:03
学习一下
作者: morgile 时间: 2020-3-9 16:09
非常感谢版主分析
作者: 郭密密专用账号 时间: 2020-4-29 22:02
厉害,谢谢分享
作者: Frostmournk 时间: 2020-6-17 09:58
谢谢分享
作者: 好好学习 时间: 2020-6-26 21:59
谢谢分享
作者: huaxiljw 时间: 2020-7-2 17:54
谢谢分享
作者: qqpiglet 时间: 2020-9-10 16:48
谢谢大神分享！
作者: 秋水度 时间: 2020-9-26 22:38
了解一下
作者: Dr_yxc 时间: 2020-9-30 23:11
外泌体转化医学的大门 已经打开
作者: 小杰子59 时间: 2020-10-8 16:06
很好的文章 可以学习下
作者: xbym1901 时间: 2020-10-9 17:44
很好的文献，谢谢，求原文
作者: myjhyb 时间: 2020-12-8 10:03
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作者: Ruby 时间: 2021-1-14 11:26
感谢分享
作者: zz562 时间: 2021-3-9 10:49
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作者: 不止不行 时间: 2021-6-1 21:56
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作者: dongfeng 时间: 2022-3-9 10:55
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作者: 甘宁1234 时间: 2022-3-28 18:41
我没惹吗 绿豆沙
作者: yujunzhang 时间: 2022-3-29 10:05
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作者: sunyongpei924 时间: 2022-5-12 12:34
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作者: love128227 时间: 2022-6-7 08:58
学习，！！！
作者: zlstc 时间: 2022-6-7 15:03
谢谢分享
作者: Betsyna 时间: 2022-6-8 10:40
请问，怎么看到文献？
作者: yccc 时间: 2022-9-7 09:23
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