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标题: miRNA引物自己设计靠谱吗? [打印本页]

作者: kadak007    时间: 2015-9-2 14:27
标题: miRNA引物自己设计靠谱吗?
请教下各位,从exo中提取miRNA,逆转为cDNA, 再行PCR,我所用的试剂盒不提供miRNA的上游引物,
你们是从公司直接订购miRNA引物,还是自己设计好让公司合成呢?
网上有很多miRNA引物设计的信息,看起来挺简单,不知道可靠性怎样......
给点建议把,谢谢~


作者: kadak007    时间: 2015-9-3 21:51
Johnny 发表于 2015-9-2 22:12
靠谱!我们实验室做miRNA的都是自己设计引物的

版主,麻烦看下这个设计方法靠谱吗? 可行的话我就按这个办

以hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU。
每个正向引物带有一段固定的序列,固定的序列为:GGG
在这个序列后加上于成熟体 除后面6个外 剩下的碱基序列,成熟体除掉后面6个碱基后序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGA,把U变成T即可,最后的序列为:5,-GGG GTCCAGTTTTCCCAGGA -3,

作者: kadak007    时间: 2015-9-5 18:01
Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法,他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物, ...

很详细很给力,谢谢版主指导~
作者: kadak007    时间: 2015-9-7 10:40
Johnny 发表于 2015-9-5 18:46
不客气~~~~~~~~~~

版主,关于引物设计的后续规范再麻烦下:
我所用的miRNA荧光定量检测试剂盒已提供下游引物,估我只需提供上游引物序列,以hsa-mir-145为例,即提供5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3即可
1、公司要求提供 OD值 和 纯化方式。这个怎么写?有惯例吗?
2、我用的试剂盒提供的下游引物Tm值65℃,故建议上游引物Tm值为65℃左右。我用DNAstar检测引物,Tm值为72.7℃。那我只保留固定序列中的一部分(AGCTGGG ),使TM值为64.6℃。这样做可行吗?
麻烦指导下,谢谢~~
作者: kadak007    时间: 2015-9-7 19:52
Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系,能P出来就行

好的,多谢~
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-27 13:43
Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系,能P出来就行

版主,颈环引物设计好随便交给哪个公司都可以吗?还是说要送给特定的公司设计才能用啊?
作者: 烟尽云淡    时间: 2017-9-2 21:06
Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法,他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物, ...

Johnny大神,想请教下,我看你们的经验“正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG”,想问下,你们这段固定的序列是自己摸索出来的哇?
而且,我一一看了你下面列举的你们设计的FP,发现好像前面并没有ACACTCCAGCTGGG这段固定序列呢?
作者: afra    时间: 2017-9-21 14:36
Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法,他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物, ...

大神,还麻烦问一下,逆转录用的kit?
另外,这个univeral reverse primer是什么用途?

谢谢大神!
作者: wchl0918    时间: 2018-8-3 08:28
多谢分享,受教受教
作者: zhang4083    时间: 2018-9-24 23:11
本帖最后由 zhang4083 于 2018-9-24 23:12 编辑

我怎么觉得版主给我讲糊涂了,版主能不能出来,再给普及一下知识呀,
对我这种小白来说,
你这反向引物,正向引物,还有Universal Reverse Primer引物,以及后面的Taq引物给我整糊涂了?

是不是第一个反向引物是逆转录引物。

而正向引物和universal reverse primer才是反向引物呀。
作者: Mango218    时间: 2019-10-3 19:27
microRNA加尾法引物在文献中多吗
作者: xlyz    时间: 2020-4-6 12:53
大神们可否告诉我提外泌体RNA的试剂盒和逆转录的试剂盒是哪个呀??




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