外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用
标题:
关于血浆外泌体提取的疑问
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作者:
羽翼灬世羡
时间:
2020-10-12 10:06
标题:
关于血浆外泌体提取的疑问
本文前后提取过几次血浆外泌体，流程如下:
小鼠眼眶取血，3000g*30min，13000g*30min，-20保存；超高速离心前融化13000*10min，合并小鼠血浆，贝克曼15ml规格离心管，加入3ml左右血浆和12mlPBS，然后110000g*2h，完成后吸取上清（留下底部2-3ml），加入12-13mlPBS，110000g*70min，完成后小心吸去或倒掉上清液，加入50μlPBS重悬。
问题是：1，血浆冻融后会有白色或透明胶质样物质（应该是血浆中的纤维蛋白成分），13000g并不能使其完全沉底，导致部分混入最终110000g的超高速离心，而最终与底部外泌体混在一起。
2，外泌体离心全程不可见，并不清楚整个过程操作是否正确，最终样本是否真的含有外泌体，western检测显示有阳性蛋白，但因为血浆来源且并不纯，阴性蛋白也显示阳性。而电镜或者NTA暂时不具备实验条件
想知道各位大佬提取血浆外泌体时候是否遇到过问题1中的胶质样物质以及如何解决，或者超高速离心提取外泌体时是否能肉眼观察到离心管底的外泌体。
谢谢。
作者:
ij1211
时间:
2020-10-12 11:05
我觉得你可以把血浆先稀释后在进行后续的离心，防止由于血浆蛋白浓度过高与纤维蛋白一起聚沉，超离前还是有必要进行适当的高速离心。个人观点仅供参考，外泌体的三个鉴定实验是相辅相成的尽量还是都做了才能说明问题。
作者:
羽翼灬世羡
时间:
2020-10-13 08:45
ij1211 发表于 2020-10-12 11:05
我觉得你可以把血浆先稀释后在进行后续的离心，防止由于血浆蛋白浓度过高与纤维蛋白一起聚沉，超离前还是有 ...
谢谢，我超离心的时候用的是贝克曼15ml的管子，就是3ml血浆+12mlPBS来离心的，您的意思是超高速离心前置步骤离心的时候就进行PBS稀释吗
作者:
羽翼灬世羡
时间:
2020-10-14 10:12
求各位大佬指点一下呀呀呀呀
作者:
不会选昵称
时间:
2020-11-5 10:26
本帖最后由 不会选昵称 于 2020-11-5 10:28 编辑
最近在做细胞上清提取外泌体，先是去死细胞去碎片，然后用超滤管浓缩大约30倍的体积来超速离心，两次超速离心能看到沉淀，可是最后BCA定量却浓度很低，连续做了几次都是这样，求大神帮忙！
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