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标题: 讨论:血清外泌体提取后杂marker条带-背景高 [打印本页]

作者: 子非鱼    时间: 2016-1-14 11:23
标题: 讨论:血清外泌体提取后杂marker条带-背景高
本帖最后由 子非鱼 于 2016-1-15 23:37 编辑

    RT:鄙人用SBI ExoQuick提取血清中的外泌体,试了4次终于跑出条带了:CD63、CD9、Flotillin1都砸出来了,虽然条带不美观(窃以为为血清中油脂去除不彻底)还需优化条件。在此,有点小建议给做血清的小盆友,一定要按照protocol来,我的经验告诉我,SBI盒子做的千万别自行提高蛋白浓度跑电泳杂条带,因为会神马都没有,还有乌云罩顶的背景(大概油脂太多)。    在此,也希望做过血清外泌体的大神们给点建议:如何在血清提取外泌体前去除肉眼看不到的油脂,一个朋友建议将血清拿来再13000g离心15-30min,可是SBI试剂盒要求3000g离心30min即可,所以有点迷惑,加大离心力会对血清中的外泌体提取前有影响不?
    PS:上几张图:大家帮我分析下,黑黑的一团一团的东西是什么原因,是油脂吗?
    PPS:CD63砸到两条条带:25kDa和50kDa处
新鲜western出炉咯~~(Ppps:私心作怪,好图留用,把最不清楚的图放上了,希望大家谅解!另外:还需更正一个问题,起初上的条带中:Flotillin1是上面最浓浓一团那个,不是下面细细的那些,今天把膜和相片好好比对了一番确认的,如有误导向大家道歉了!)
   说一下此次的条件:仍然250μl血清按比例+试剂(A:0.22μm微孔膜过滤),提取exosome后的血清,查网上帖子说60-80μg的蛋白浓度,需稀释至少10倍再上样,此处由于稀释液准备不够,只进行了4倍的稀释(RIPA稀释),+5Xloading buffer,每个well上样6μl,然后120V浓缩胶,200V分离胶,250mA恒流湿转,5%脱脂牛奶封闭4摄氏度overnight,次日一抗孵育RT,3h;TBST洗:10minX3次;二抗孵育RT,1h;TBST洗:10minX3次;发光液加,成像仪显像,over!

作者: 子非鱼    时间: 2016-1-14 11:25
另外,红线划到的地方为目的条带

作者: hzangs    时间: 2016-1-14 12:20
子非鱼 发表于 2016-1-14 11:25
另外,红线划到的地方为目的条带

看着挺不错的结果~~
有一个问题~
有没有看一下, 单杂血清  或者去掉exosome的血清  有没有这些条带?
血清成分很复杂,可能有些exosome表面marker在血清里有游离存在的。
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-14 12:39
hzangs 发表于 2016-1-14 12:20
看着挺不错的结果~~
有一个问题~
有没有看一下, 单杂血清  或者去掉exosome的血清  有没有这些条带?

     斑竹,还没看呢,之前看到帖子说血清蛋白复杂,westernt不好做,我就先没做,而且只上exosome,都这么多油脂.......
    这次我优化下条件再做一次,顺带把提exosome后的血清也跑一次,再跟斑竹汇报吧~
作者: hzangs    时间: 2016-1-14 13:32
子非鱼 发表于 2016-1-14 12:39
斑竹,还没看呢,之前看到帖子说血清蛋白复杂,westernt不好做,我就先没做,而且只上exosome,都这 ...

我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~
作者: xinyi717    时间: 2016-1-14 22:48
太谢谢了,感谢分享,给楼主一个拥抱~
作者: xinyi717    时间: 2016-1-14 22:53
还有想问一下试剂盒中有提到用500微升血清,但感觉不同病人血清也会不同,可能内含外泌体的量也不同,不知楼主是否有遇到这种情况呢?是否有需加大血清量和对应的试剂量呢?谢谢楼主~
作者: wooway    时间: 2016-1-15 09:03
楼主是用多少血清提的外泌体,然后提的蛋白?你的上样量大概是多少?我也是做血清外泌体,最近准备补WB
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-15 11:19
xinyi717 发表于 2016-1-14 22:53
还有想问一下试剂盒中有提到用500微升血清,但感觉不同病人血清也会不同,可能内含外泌体的量也不同,不知 ...

亲,小楼也是刚开始做,提了4个血清样本,肉眼看都差不多的沉淀,外泌体的浓度还没有测过,因为好麻烦的说,每次都要制作标准曲线,今晚会测一次。个人以为:病人不同所含外泌体就不尽相同,应该所有样本都定量提取,是多少都是多少,个人建议,请谨慎参考^_^
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-15 11:31
wooway 发表于 2016-1-15 09:03
楼主是用多少血清提的外泌体,然后提的蛋白?你的上样量大概是多少?我也是做血清外泌体,最近准备补WB ...

    先回答你问题:250μl血清配比试剂,提取外泌体后,200μlRIPA裂解,上样10μl
    PS:哎,这里允许小楼少许啰嗦,给各位提个醒,估计没人会犯我这种错误:小楼刚开始用2个500μl血清配比试剂分别提取的外泌体,怕量少再没有任何根据的情况下,盐水稀释后,一份仅加了200μl盐水+loding buffer、一份仅加了200μl的RIPA裂解+loading buffer(此处:注意量),最后沸水煮5min,western上样10、20μl的都有,结果神马都没跑出来,跑了三次还是神马都没有,最后分析到可能是样本浓度过高,后来重新提了一次,这回老老实实找出protocol,踏踏实实按步骤来,即:250μl血清配比试剂,提取外泌体后,200μlRIPA裂解,上样10μl(适当调低,因为我的CD63条带好浓的说~),终于跑出了以上不甚美观的结果。当然这里各个步骤设了好多质控,才发现
    最后祝你出个漂亮条带!
作者: wooway    时间: 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝!我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后是否会再离心一次去除沉淀,之后再加LOADING buffer煮!然后你RIPA裂解液是什么品牌的,我一直用的我们平时裂解细胞的裂解液!
作者: wooway    时间: 2016-1-15 14:18
这是我考马斯亮蓝的图!!!!
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-15 18:40
wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝!我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

裂解之后没再离心了直接加loading了,你可以试试离心,我用的裂解液是实验室技术员配制的RIPA,具体成分品牌我现在不清楚.......还有你的考马斯在哪里?我么有看到
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-15 18:46
wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝!我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

补充一句:我用的和裂解细胞的一样,据说有童鞋没加裂解液也可以做出来,我之前设了这个对照,但因为上样量的原因,结果不好,但是应该是可行的,感觉裂解液有作用,但没辣么大,感觉“加不加裂解液”不是”有或无“的结果,wooway可以试试,祝成功~
作者: wooway    时间: 2016-1-15 22:43
子非鱼 发表于 2016-1-15 18:40
裂解之后没再离心了直接加loading了,你可以试试离心,我用的裂解液是实验室技术员配制的RIPA,具体成分 ...

图片传不上去不知道啥子个情况。。。
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-16 11:47
hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

斑竹,昨晚刚出锅的条带,有空来看~
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-16 11:49
hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

提取exosome后的血清,查网上帖子血清浓度太高,约有说60-80μg的蛋白浓度,需稀释至少10倍再上样,此处由于稀释液准备不够,只进行了4倍的稀释(RIPA稀释),+5Xloading buffer,每个well上样6μl。
作者: hzangs    时间: 2016-1-16 11:51
子非鱼 发表于 2016-1-16 11:49
提取exosome后的血清,查网上帖子血清浓度太高,约有说60-80μg的蛋白浓度,需稀释至少10倍再上样,此处 ...

谢谢~
这么看  确实有些marker蛋白可能在血清中游离。  不过exosome样品还是会富集的。  谢谢你的数据~~
作者: hzangs    时间: 2016-1-16 11:53
子非鱼 发表于 2016-1-16 11:49
提取exosome后的血清,查网上帖子血清浓度太高,约有说60-80μg的蛋白浓度,需稀释至少10倍再上样,此处 ...

也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的?
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-16 15:02
本帖最后由 子非鱼 于 2016-1-16 15:03 编辑
hzangs 发表于 2016-1-16 11:53
也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的?

说实话,是不是一致我不确定,样品我都分出来一些,晚上统一测浓度看看~
作者: 子非鱼    时间: 2016-1-18 15:57
子非鱼 发表于 2016-1-16 15:02
说实话,是不是一致我不确定,样品我都分出来一些,晚上统一测浓度看看~ ...

已鉴定,总蛋白浓度,血清浓度70μg/μl,对应外泌体浓度是17μg/μl,约4倍的关系。
作者: hzangs    时间: 2016-1-19 09:03
子非鱼 发表于 2016-1-18 15:57
已鉴定,总蛋白浓度,血清浓度70μg/μl,对应外泌体浓度是17μg/μl,约4倍的关系。 ...

谢谢你的数据 ~~   这样就解决了一个很大的问题呢
作者: hengheng37    时间: 2016-6-16 20:08
楼主你做了电镜吗,我也是用SBI提的血浆,电镜结果背景很杂,而且也没看到典型的外泌体形态,不知道你是什么情况
作者: 子非鱼    时间: 2016-7-6 09:58
hengheng37 发表于 2016-6-16 20:08
楼主你做了电镜吗,我也是用SBI提的血浆,电镜结果背景很杂,而且也没看到典型的外泌体形态,不知道你是什 ...

做了,有两张像,wester也做了,但是后期再补做一下
作者: JKF    时间: 2017-12-22 21:14
楼主,我想请教一下,第一孔的是用0.22μm过滤之后的,过滤是在收集沉淀之后过滤离心还是提取之前离心?
作者: ronaldchen    时间: 2018-1-12 14:58
请问楼主用的cd63抗体的货号,谢谢
作者: 子非鱼    时间: 2018-2-15 11:34
ronaldchen 发表于 2018-1-12 14:58
请问楼主用的cd63抗体的货号,谢谢

Abcam买的 去查吧
作者: 1992caoyan    时间: 2018-8-8 16:56
你好,我想问问,我用的SBI血清外泌体提取试剂盒,用250微升血清样本提外泌体,提取的外泌体有一颗绿豆大小的黄色沉淀,这是杂蛋白吗,用1ml TRIZOL也溶解不了,我不是做外泌体中蛋白检测,是用外泌体来提取RNA吗,有什么办法可以把杂蛋白去除?




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