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标题: 【投稿经验】审稿人对SBI试剂盒的疑问及解决 [打印本页]
作者: 惜名    时间: 2016-7-4 09:34
标题: 【投稿经验】审稿人对SBI试剂盒的疑问及解决
本帖最后由 惜名 于 2016-7-4 09:35 编辑

本人正在投一篇Scientific Reports（水刊，求大神不要嘲笑）
用SBI试剂盒提取的exo，审稿人针对这个方法提出了如下comments，分享给各位群里的战友：

In Fig. 1, western blot analysis was performed using cell lysates and exosome lysates as starting materials. However, purified exosomes, especially if a polymer-based extraction kit such as the Exo-Quick kit is used, are heavily contaminated with carry-over proteins and cell debris from the initial DC culture media. Therefore, the authors should add a control were the same exosome samples are first digested with proteinase K to eliminate extra-exosomal contaminants and then lysed and used for western blot analysis. This control would help determine whether the indicated markers are of exosomal origin or not.  




补实验中。。。都毕业了还要给自己擦屁股，唉。。。
作者: hzangs    时间: 2016-7-4 09:57
值得借鉴的意见。
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-7-4 10:01
想问一下这里面用的proteinase K 会不会也降解了exosome 膜上的蛋白呢，还有这个降解时间怎么控制呢。
作者: 惜名    时间: 2016-7-4 10:03
hzangs 发表于 2016-7-4 09:57
值得借鉴的意见。

审稿人没直接要求用超离重新做，我已经谢天谢地了，哈哈
作者: 惜名    时间: 2016-7-4 10:03
微泡biomarker 发表于 2016-7-4 10:01
想问一下这里面用的proteinase K 会不会也降解了exosome 膜上的蛋白呢，还有这个降解时间怎么控制呢。 ...

我也不知道咋控制时间，打算查查资料先试试。。。
作者: hzangs    时间: 2016-7-4 10:36
惜名 发表于 2016-7-4 10:03
审稿人没直接要求用超离重新做，我已经谢天谢地了，哈哈

proteinase K 这样处理 有人做过？
作者: 惜名    时间: 2016-7-4 10:43
hzangs 发表于 2016-7-4 10:36
proteinase K 这样处理 有人做过？

这个方法我在文献里也没看到过。
但考虑到我现在是补实验，肯定要尊重审稿人的意见了，打算先这样做起来。
这个审稿人既然提出了这个建议，或许也是外泌体的“业内人士”。。。
作者: yanyanchan618    时间: 2016-7-4 11:00
对啊，起码没有全盘否定试剂盒的提取效果。
作者: hzangs    时间: 2016-7-4 11:05
惜名 发表于 2016-7-4 10:43
这个方法我在文献里也没看到过。
但考虑到我现在是补实验，肯定要尊重审稿人的意见了，打算先这样做起来 ...

嗯  同行评议嘛     反正目的是投出去    投reviewer的所好吧~
作者: 惜名    时间: 2016-7-5 09:02
Johnny 发表于 2016-7-4 18:19
惜名兄棒棒哒 O(∩_∩)O~

水刊，以后都不好意思讲。。。
作者: hereissyk    时间: 2016-7-5 10:46
感觉SBI的影响力还是蛮大的，直接否认相当于否认了那么多文章，所以审稿人如果要拒也不会以这里理由拒绝的，所以还是用超离做比较安全。。。
作者: 下里巴人    时间: 2016-7-5 13:06
看来还是得用超离啊！就是费时费力好心塞。。。。。。
作者: linxian    时间: 2016-7-7 16:32
你好，我想问你用的是什么裂解exosome收取外泌体蛋白的？现在在做这方面的工作，但不知道怎么裂解外泌体并得到其蛋白，恳请相告。
作者: 惜名    时间: 2016-7-7 17:56
linxian 发表于 2016-7-7 16:32
你好，我想问你用的是什么裂解exosome收取外泌体蛋白的？现在在做这方面的工作，但不知道怎么裂解外泌体并 ...

我用RIPA裂解。
作者: linxian    时间: 2016-7-8 10:23
RIPA是很强的那种裂解液吗？裂解效果和蛋白浓度怎么样？
作者: 暂无昵称    时间: 2016-7-8 11:42
求教，外泌体加裂解液的量一般怎么确定呢？或者有参考文献吗？谢谢！！！
作者: 惜名    时间: 2016-7-10 09:05
暂无昵称 发表于 2016-7-8 11:42
求教，外泌体加裂解液的量一般怎么确定呢？或者有参考文献吗？谢谢！！！ ...

自己摸索。。。每种细胞分泌的外泌体量都不一样，你用的提取方法也会影响产量啊。。。
作者: 王一刀    时间: 2016-7-13 10:42
真羡慕你啊，能发5分的文章就很好了，我还在苦苦摸索中，前途暗淡啊
作者: 子非鱼    时间: 2016-7-18 14:58
不知楼主的PK实验补充得怎么样了，期待
作者: 惜名    时间: 2016-7-25 21:31
子非鱼 发表于 2016-7-18 14:58
不知楼主的PK实验补充得怎么样了，期待

最近在搞入职的流程，要进入医院工作了。。。补实验神马的，唉，都是泪。。。
作者: 子非鱼    时间: 2016-7-26 15:14
惜名 发表于 2016-7-25 21:31
最近在搞入职的流程，要进入医院工作了。。。补实验神马的，唉，都是泪。。。 ...

额......好吧，祝入职顺利，工作愉快！
Ps：补实验神马的，泪归泪，也还是要补的，期待ing
作者: 空谷跫音    时间: 2016-7-26 22:45
大神，我也用跟你一样的试剂盒提的外泌体，请问你提完后怎么保存外泌体的，放在什么溶液里？杂志蛋白含得多吗，后续好进行吗？谢谢
作者: 惜名    时间: 2016-8-27 09:30
空谷跫音 发表于 2016-7-26 22:45
大神，我也用跟你一样的试剂盒提的外泌体，请问你提完后怎么保存外泌体的，放在什么溶液里？杂志蛋白含得多 ...

用PBS保存，如果短期内用，我会放在-40度（这个冰箱在实验室里，比较方便）。如果比较长期保存，放在-80堵（这个冰箱在地下室，取用麻烦）。我个人经验，如果是几天之内用的，放在-40肯定没问题~做细胞功能干预、染色标记、蛋白、RNA等都没问题
作者: 空谷跫音    时间: 2016-10-11 18:46
惜名 发表于 2016-8-27 09:30
用PBS保存，如果短期内用，我会放在-40度（这个冰箱在实验室里，比较方便）。如果比较长期保存，放在-80 ...

谢谢啦
作者: 我是小白    时间: 2016-10-20 12:03
请问版主，对于蛋白酶K的量控制，或者是具体的操作过程如何做呢？如果加入Triton-100行不行呢？有没有文献支持呢?求分享
作者: 惜名    时间: 2016-10-21 17:18
我是小白 发表于 2016-10-20 12:03
请问版主，对于蛋白酶K的量控制，或者是具体的操作过程如何做呢？如果加入Triton-100行不行呢？有没有文献 ...

这个我也不知道，哈哈
作者: 君扬2009    时间: 2016-10-25 09:49
求蛋白酶K经验
作者: LarryYang    时间: 2017-3-16 13:04
版主，你好！我也用SBI试剂盒提培养基的外泌体，根据他提供的protocol来的，但是做WB几个标志蛋白都做不出来，求指教！！！
作者: moa528    时间: 2017-7-22 15:43
LarryYang 发表于 2017-3-16 13:04
版主，你好！我也用SBI试剂盒提培养基的外泌体，根据他提供的protocol来的，但是做WB几个标志蛋白都做不出 ...

后来做出来了吗？我遇到了相同的问题
作者: haks    时间: 2017-10-19 23:38
惜名 发表于 2016-10-21 17:18
这个我也不知道，哈哈

100 μg/ml of proteinase K at 37°C for 30 min to remove surface proteins
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895447/




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