求助！试剂盒提取血清exosomes

哈利郭特 · 发表于 2015-3-13 15:26:33

各位大神我用了life和SBI的试剂盒提血清的exosomes感觉总是有问题
SBI说明书后边有一个做western的protocol
1. If frozen, thaw culture media or urine sample on ice
2. Combine 500µl serum + 120 µl ExoQuick
3. Mix well by inversion three times
4. Place at 4ºC for 30 minutes (or up to12 hours)
5. Centrifuge at 1500 × g for 30 minutes
6. Remove supernatant, keep exosome pellet
7. Centrifuge at 1500 × g for 5 minutes to remove all traces of fluid (take great care not to disturb the pellet)
8. Add 200 µl RIPA buffer to exosome pellet and vortex 15 seconds
9. Place at room temperature for 5 minutes (to allow complete lysis)
10. Add Laemmli buffer (with Beta-mercaptoethanol) and heat at 95⁰C for 5 minutes.
11. Chilled on ice for 5 minutes before loading onto gel
12. Perform standard SDS-PAGE electrophoresis and Western transfer onto PVDF membrane
13. Block with 5% dry milk in Tris Buffered Saline + 0.05% Tween (TBS-T) for 1 hour
14. Incubate blot overnight at 4°C with SBI's exosome specific antibody (e.g. CD9) at 1:1000 dilution (5% dry milk in TBS-T)
15. Wash 3X with TBS-T
16. Incubate one hour at room temperature with SBI's Goat anti-Rabbit-HRP antibody at 1:20,000 dilution (5% dry milk in
TBS-T)
17. Wash 3X with TBS-T
18. Incubate blot with chemi-luminescence substrate and visualize on film or other imaging equipment

我基本上是按照说明书做的但是做了很多次都没有结果请问500ul血清能不能提出eoxosmes？加入试剂之后会看到明显的黄色沉淀用RIPA裂解液可以重悬但感觉好像不能完全裂解有没有必要再离心一下去除沉淀？有没有什么注意事项求指点试剂盒都快用完了一个条带都木有

谢谢！

哈利郭特 · 发表于 2015-3-16 16:00:29

Johnny 发表于 2015-3-13 21:12
我觉得试剂盒提出来的那一大坨很可能是杂蛋白，不是exosome。阳性样本如果能杂出来，就肯定不是你WB的问 ...

多谢～我再研究研究

zyjjxb · 发表于 2016-4-1 16:25:40

我也是啊，血清600ul.用试剂盒提取后黄色粘稠状沉淀比较多，加入裂解液，想吹打下都沾在枪头上了，BCA测蛋白浓度太可怕，都上万了！

xinyi717 · 发表于 2016-1-15 10:35:46

同样想问下楼主，不知现在如何呢？谢谢

子非鱼 · 发表于 2016-1-14 11:05:53

哈利郭特发表于 2015-3-18 17:14
好的谢谢指点～

时间久远，不知道楼主做得怎么样了？

hzangs · 发表于 2015-10-9 10:53:56

qEV exosome分离柱可以的。我尝试过它分离血清中的外泌体还行，也比较干净

iiibuick · 发表于 2015-9-9 08:29:08

刚买了个SBI的试剂盒，也是提取细胞培养液里的exosome的，还没开始做，但是说明书里说的 use as little as 5mL media or urine samples，你会不会用的太少了

大琳宝儿 · 发表于 2015-4-5 13:32:07

插问一个很细节的问题，再用SBI试剂盒提取的时候，加完提取液，他说要Refrigerate30,min，这个是冷冻还是冷藏啊 4度还是-20？
另外，我通过研磨组织，提取组织细胞间液的exosome，加的比例和时间很难掌握，我看SBI试剂盒对腹液的要求是12h，那组织间液是不是野德挺长时间啊？嘿嘿自己实在没注意了，大家一起帮我参谋参谋~谢谢啦

哈利郭特 · 发表于 2015-3-18 17:14:29

hzangs 发表于 2015-3-18 10:04
个人感觉，可以考虑换一个抗体杂一杂，不同组织和细胞分泌的exosome所携带的表面蛋白marker的丰度存在一 ...

好的谢谢指点～

hzangs · 发表于 2015-3-18 10:04:30

哈利郭特发表于 2015-3-13 18:08
报告版主我只检测了CD63 莫非是人血清里CD63含量太低了？而且我觉得有点不可思议用差速离心的方法500ul ...

个人感觉，可以考虑换一个抗体杂一杂，不同组织和细胞分泌的exosome所携带的表面蛋白marker的丰度存在一定差异。

哈利郭特 · 发表于 2015-3-16 16:01:00

fan 发表于 2015-3-14 11:21
个人感觉你的蛋白浓度很高的。500Ul血清应该是能提取很多的。当然杂蛋白肯定有。不妨你把蛋白的浓度做 ...

thanks～我回头试一下

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