有没有简单好用又便宜的miRNA qPCR检测方法？

hzangs · 发表于 2017-3-15 13:50:46

本帖最后由 hzangs 于 2017-3-20 19:35 编辑

没有？

这个可以有！！！而且hzangs对该方法进行了测试！引物的评判一般考虑特异性和扩增效率，特异性可以通过qPCR溶解曲线的峰型得出，而扩增效率需要比较不同方法、不同引物对同一基因的扩增效果才可得出。考虑到扩增效率评定比较繁琐，所以hzangs在测试时只考察了引物的特异性问题。hzangs利用该软件设计引物10对，以抽提的细胞total RNA作为起始RNA，利用该策略进行qPCR检测。其中7对在所有样品中溶解曲线均为单峰，2对在个别样品中出现杂峰，1对在所有样品中出现杂峰。另：出现杂峰的3对引物，其中2对引物的CT值在30以上，可以认为是极低丰度miRNA。
补充两点：1、生成的引物在 运行算法  后产生的新文档里！！！ 2、加尾后 RNA不需要纯化，直接吸取一定数量加尾反应液进行逆转录即可。
软件在此！  方法请见微信推文！  链接：https://mp.weixin.qq.com/s/JoJczBvNTG76GpXbygca8g
使用该方法发文章，记得引用原发明人的论文。
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释疑：
推出该方法后有朋友在微信后台留言认为这就是常规的加尾法检测miRNA，用软件设计加尾法miRNA引物本身就是个错误。 hzangs首先在这里感谢这位朋友的批评和意见。不过对于技术的探讨是仁者见仁智者见智的事情。
hzangs在此解释一下该方法与传统加尾法检测miRNA的技术差别：
传统的加尾法上游引物是miRNA序列本身，下游则是通用引物。通用引物的问题在于没有特异性，传统加尾法miRNA qPCR的引物特异性完全依靠上游引物，这就导致了传统的方法特异性低，qPCR过程容易出现非特异性扩增等问题。hzangs分享的方法下游引物的3‘端引入了靶miR的几个碱基，增强了特异性。同时基于引物设计软件自带的算法选择了下游引物3'端与靶miRNA匹配的碱基数。这也是为什么该方法需要引物设计软件的原因。如果大家还有什么问题，可以在本帖留言，与hzangs就该方法进行讨论。

mervynzcy · 发表于 2019-5-5 16:42:44

您好，请问能分享一下您买的polyA加尾酶的货号吗

Tantan717 · 发表于 2024-12-16 10:48:32

谢谢您！目前正在学习中

赵静 · 发表于 2024-7-16 16:50:26

谢谢分享

lqw12406 · 发表于 2024-3-20 16:21:23

参照方法先试试效果！

ahhy_xx · 发表于 2023-11-22 20:48:07

gywfind · 发表于 2023-9-25 15:38:46

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gywfind · 发表于 2023-9-25 15:37:14

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