求助！关于凯杰exoEasy Maxi kit提取的exosome的WB

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求助！关于exosome蛋白的western blot，我做的是CD63的鉴定，用的是Qiagen厂家的exoEasy Maxi kit试剂盒提取的细胞上清15ml的外泌体（共6个不同时间点的样本），最后溶于500ul XE buffer。前后一共做了6次WB，起初是没有用裂解液，配的10%胶，直接取20ul加相应的loading buffer，100度变性后上样，然后出来的条带是连续一条直线，之后改了各种试剂及条件，仍是一条线，我怕是自己的技术问题，同时期同条件下还跑了以前剩余的普通蛋白标本，杂的是GAPDH，跑出来的泳道间隔都没问题，证实我的技术还行。于是在最后一次加了裂解液（MPER+PMSF）后，显影竟然是白板，Oh MY GOD，我想死的心都有了。也翻阅了好多文献，但是都不是说的很具体详细。寻寻觅觅终于找到组织了，求助各位大神

zhaozhi

请问楼里的人：该试剂盒提取的外泌体中途用XE BUFFER 洗脱后，后续WB鉴定是直接就加裂解液了吗？

wwpapple

您好，请问您用凯杰的这个试剂盒提15ML细胞上清，获得的外泌体的量可以用BCA检测到吗？谢谢

EVA120120

BCA法测浓度时，需要先将外泌体裂解吗？

smile扣子

蓝泪陨星 发表于 2017-12-7 21:39
有没有用BCA 测蛋白浓度？如果测了浓度多少？我之前也是用的这个试剂盒，感觉提出来的外泌体量太少了：16ml ...

我做了几次直接测浓度太低不显示，冻干蛋白后浓度才勉强到1，做WB效果很差，请问有新进展吗？

蓝泪陨星

有没有用BCA 测蛋白浓度？如果测了浓度多少？我之前也是用的这个试剂盒，感觉提出来的外泌体量太少了：16ml上清，只有几十微克每毫升的外泌体。

范范

请问楼主觉得这款试剂盒提取外泌体效率和纯度怎么样呢，最近刚入手准备做呢，想请教一下楼主每次用多少量的细胞上清呢，最后用多少量 BUFFER XE洗脱呢，还有就输这个柱子可以重复利用吗？问题有点儿多。。。还望楼主不吝赐教

katuysha

hzangs 发表于 2017-6-1 11:03
用的不多了。 提取RNA 个别时候偷懒 会用PEG

好的，谢谢了。

hzangs

katuysha 发表于 2017-5-31 22:00
去年那个PEG沉淀法还用吗？

用的不多了。 提取RNA 个别时候偷懒 会用PEG

katuysha

hzangs 发表于 2017-5-31 15:35
超离，基本一直在超离。

去年那个PEG沉淀法还用吗？