外泌体处理细胞

向荣y · 发表于 2015-4-15 17:47:42

有没有做外泌体处理细胞的？一般设置什么样的浓度梯度啊？

惜名 · 发表于 2015-7-8 10:54:36

梦想照进现实发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读，谢谢！

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章，你仔细去找找，大都能找到一些剂量。

惜名 · 发表于 2015-7-21 08:49:04

本帖最后由惜名于 2015-7-21 08:54 编辑

kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主，请指导下，PBS-exo处理细胞，你一般让它们共同孵育多久呢？按小时算，还是按天算？ ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
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如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用，那么时间应该是很快的，只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达，数小时就可以了。如果做蛋白，那就得16-24小时。
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如果你推测exo是通过里面的miRNA作用，那么时间就得参照转染miRNA的了，例如，我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。

惜名 · 发表于 2015-4-19 10:46:07

ffp1988 发表于 2015-4-18 10:09
您所说的10ug/ml是指？？外泌体的浓度？怎么测出来的？

10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为外泌体无法用Nano或电镜测浓度（或粒子数），文献多用蛋白量来间接反应外泌体浓度。
譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。
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这里还有一个问题，10ug/ml的浓度只是相对你的实验体系而言的，因为目前认为不同的提取方法会导致exo纯度不一。例如有人认为kit提取的exo含有杂蛋白，这无疑会增加裂解后测得的蛋白浓度，因此使得不同提取方法之间的“外泌体浓度”没有可比性。
梯度密度离心法得到的exo或许目前认为是最纯的。

惜名 · 发表于 2015-7-2 10:02:24

kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主，完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的蛋白，供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液，每ul约0.2ug。

kadak007 · 发表于 2015-6-25 23:38:02

丁倩倩发表于 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低

惜名在5楼回复时写到：“譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。”
仔细读完后，感觉他还是分两步走的，同时提2批等量的exo，1批裂解后测浓度；明确浓度后，另一批处理细胞。

丁倩倩 · 发表于 2015-4-16 20:57:59

我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为是提取试剂盒中携带的试剂毒性），我之前做过浓度梯度，现在一般都用10ug/ml

cyanwing · 发表于 2022-2-12 23:41:29

感谢各位大神的指点！

minterist · 发表于 2021-7-29 17:03:36

丁倩倩发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

请问具体哪篇文章能分享一下吗？谢谢啦

赤道的边际 · 发表于 2020-12-9 12:53:07

惜名发表于 2015-7-8 10:54
这篇Nature immunology ，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation 用的是exo粒子数定量。
这篇 ...

请问外泌体处理细胞时是直接加进去孵育吗？多久时间呢？需要spin down处理去孵育吗？

atlanticocean · 发表于 2017-11-13 08:14:05

惜名发表于 2015-7-2 10:02
我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的 ...

多大的孔？96孔板的孔？

雪岭御剑 · 发表于 2017-2-22 15:57:24

丁倩倩发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

请问你说的10微克每毫升是每次换液都加一次这么多外泌体吗？

lucida1973 · 发表于 2016-10-31 19:37:25

惜名发表于 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓 ...

马克一下

ashey · 发表于 2016-10-13 17:08:21

向荣y 发表于 2015-4-20 13:11
多谢惜名！！我用的间充质干细胞外体，180ML上清重悬到1.2ml的PBS中，加到种有肿瘤细胞的96孔板里，做了 ...

你好，现在准备肿瘤细胞培养上清外泌体处理细胞了，不知道你180ml上清提取的外泌体浓度大概是多少啊？做MTT实验时加入最大外泌体浓度体积是多少？

中义 · 发表于 2016-9-29 13:49:23

感谢各位大神精彩讨论，学习学习！！！

lucida1973 · 发表于 2016-7-15 03:16:47

这个帖子太需要了，谢谢给位的分享！！！！

kadak007 · 发表于 2016-3-14 16:05:43

惜名发表于 2015-7-21 08:49
这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
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如果你推测exo可以通过膜 ...

惜名版主，留言中提到 “做蛋白，16-24小时”，这个经验最开始有没有文献出处呢？可否推荐下？

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