无外泌体血清的检测

CARD · 发表于 2017-7-21 09:30:29

最近用超速离心制备了一些无外泌体血清，想检测一下到底里面是否还有外泌体，有没有大神做过类似的实验，求指导如何进行WB前的处理

baishixiaoyaozi · 发表于 2017-7-21 22:02:58

有NTA的话，先检测一下超离前后血清外泌体含量的变化。
外泌体WB的话，和其他WB的没太大区别。检测tetraspanin蛋白，不同公司的抗体对热变性的温度要求不同（100度 vs. 70度）。但血清白蛋白会导致非特异条带（~60KDa），对实验结果造成一定干扰。

huangsheng · 发表于 2018-11-19 16:08:30

楼主，我想问一下，你的血清离心的时候超速多少g，多长时间啊？

CARD · 发表于 2017-7-22 12:44:31

baishixiaoyaozi 发表于 2017-7-22 01:40
我之前超离血清后，分两层。可以取样直接加loading buffer，不过很大可能是检测不到，因为外泌体含量很低， ...

谢谢您的帮助

baishixiaoyaozi · 发表于 2017-7-22 01:40:23

我之前超离血清后，分两层。可以取样直接加loading buffer，不过很大可能是检测不到，因为外泌体含量很低，而且你已经过夜超离了。

不同CD63抗体有不同要求，变性温度，是否需要还原剂。

CARD · 发表于 2017-7-22 01:10:08

本帖最后由 CARD 于 2017-7-22 01:12 编辑

baishixiaoyaozi 发表于 2017-7-21 22:02
有NTA的话，先检测一下超离前后血清外泌体含量的变化。
外泌体WB的话，和其他WB的没太大区别。检测tetraspa ...

非常感谢您的回复，我现在超速离心血清过夜以后，发现血清分成了三层，想用wb检验一下离心后的血清是否还有外泌体，可以直接取样加loading buffer变性上样跑CD63吗？DTT和RIPA可以加吗？

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