本帖最后由 落叶知秋 于 2015-5-18 23:40 编辑
在此，首先感谢Jonny为我们精心筹办的线下第二次聚会，希望外泌体之家论坛在诸位的共同努力下蓬勃发展，同时也期待大家能在这个论坛里多多交流，经验也好，疑惑也好，交流可以解惑，也可以碰撞出思维的火花。 为响应版主Jonny和惜名的号召，我也在咱们论坛里浅谈一下接触外泌体以来的一些想法和感受，主要是miRNA测序和利用transwell研外泌体功能，其中不乏有失严谨或者错误之处，请各位同胞多多批评和指正。 其实，现在大家（主要是对外泌体有所接触的人）对外泌体的态度不一，有些人对它Vehicles of IntercellularSignaling, Biomarkers and Vectors of Cell Therapy等等作用深信不已，觉得外泌体研究可以成就疾病诊断与治疗的重大突破，甚至是攻克。也有些人持有怀疑的态度，怀疑这种纳米级别的东西果真能调节肿瘤的转移？又如何延缓各种慢性疾病的进展？抑或是干细胞干性的维持等等。个人觉得“干一行，爱一行”，高分的paper来源于坚定的信念，以及不懈的努力付出。 一、外泌体microRNA的测序 其实说到测序，往事不堪回首，前前后后花了两个多月时候才收集完样本（我做的是细胞上清），或许因为正常细胞的上清，也或许是那段时间血清问题，细胞状态一直不好，所以要想完成750ml上清收集，真心不是件容易的事。 无论是文献报道还是前期nanosight结果对比,用含10%FBS培养基培养细胞后收集上清中的外泌体，其来源于血清的含量绝对不会比细胞来源的少。这其实就是目前比较困扰的很多研究人员的一个问题，如果是肿瘤细胞还好，不加FBS熬个两天细胞状态还行，但是对于有些“娇贵”的细胞恐怕就不尽人意了。Exosome-depleted 完全培养基，这个对绝大多数同学们来说不太现实，100,000 xg 过夜（16h，不过在交流会上复旦的达人用8h），更何况离的不是纯FBS，而是用培养基稀释成20%FBS的2X完全培养基，刚开始我也干过这事，200,000 xg ，2h（每次只能离心20ml），后来冷静想想，果断放弃这条路，改走“基础培养基”道路。多亏我细胞生命力旺盛，无血清培养基培养两天后细胞状态基本没有特别大的变化（FBS-free是否影响细胞的状态，影响外泌体的分泌及其内容物，暂时未有人专门研究过）。当然现在也有专门用于外泌体研究的培养基，惜名在外泌体之家有写过相关的帖子[ http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=106]感兴趣的可以了解下。 （一）、测序的过程 细胞设处理组和对照组，培养，传代，完全培养基培养48h，弃上清换液，改用FBS-free基础培养基，48h后收集上清。当然具体采用无血清培养的时间段及无血清培养时间，就看你细胞的状态了，时间越短，对细胞影响越小，相反，分泌的外泌体量也会受到影响。现在测序的公司有很多，包括一般的测序公司（例如华大等）和一些专门致力于外泌体测序的公司，例如锐博和裂冰等。这两家公司我们实验室都有做过。我选择锐博，主要是看重他们有外泌体抽提的服务，1500元/样（不管你给多少上清，直到外泌体中RNA质检合格为止），这个比较省事。另外miRNA测序收费5000多/样本，测序价格每个公司相差不是特别大，测序周期说是1个半月（但后来算算两个半月左右）。 刚开始送了200ml（100ml/样本）上清，一个礼拜后给我回信质检不合格（外泌体抽提的RNA量不够，0.5ug方能质检合格），为此，我开始大量培养细胞及收集上清，最后又送了500ml上清，这次质检合格。 左盼右盼总算是把最后的结果给盼回来了，初一看，结果不是特别让人满意，相比实验室师姐在裂冰公司做的测序结果，我的结果数据量有点少的可怜，表达差异有统计学意义的只有9个miRNA，但后来仔细分析了一下，之前研究的几个比较关键的miRNA都在其中。这点还是晒为安抚了我受伤的心灵。锐博还有一点比较好，就是送10个miRNA的通路预测，不过这就仁者见仁智者见智了。 （二）、测序的注意事项 1、一定要注意是用去exosome的培养基或者商品化血清（上文已提及）或者直接用无血清培养基，这个依据细胞状态来选择。 2、不同的细胞分泌的外泌体量不同及外泌体来源地的RNA量也有较大不同，这就造成送样量千差万别，本人的送样量仅是一个特例。
二、Tanswell 小室对外泌体功能的研究 Transwell小室在细胞功能学研究中的重要作用相信大家都再熟悉不过，其膜的孔径不同作用也不同，主要用于共培养，侵袭，迁移等功能学实验。那么它如何在外泌体的研究中扮演重要角色呢？ 外泌体50-120nm 的直径使得它能很轻易穿过孔径为0.4um 的Transwell小室，而细胞则基本不能透过0.4um的孔径，这样就使得该孔径的小室成为研究“细胞间通过外泌体的分泌来影响彼此的生物学功能”的工具。绝大部分人是将外泌体直接加入细胞上清中，然后研究其生物学特性，当然这一过程没有任何问题，这也更加直观的表明在这个过程中，外泌体起了主要作用。那么为什么还需要用到外泌体呢？个人觉得利用transwell能说明，细胞A可以通过主动分泌外泌体来影响B细胞的生物学功能，这更加符合生理学特征。当然这个过程也会给我们带来许多麻烦，所以，打算用Transwell做的小伙伴请三思而后行。
（一）基本实验过程（以研究A细胞在X因素处理下分泌的外泌体对B细胞移能力的影响为例） X因素处理A细胞，同时设置对照组，将其接种于6孔板中，贴壁完全后安放Transwell小室（膜孔径大小为0.4um，膜的面积为4.67cm2 ，通俗点说就是放在孔板中的小室），如果未完全贴壁就安放小室，则六孔板中的细胞A会因为张力作用全部跑到板周边区域（只是个人一点经验而已），在小室中接种细胞B，具体的操作方法参考附件一。 以上诉方法进行共培养，待小室中细胞密度达90%左右收集小室细胞，做凋亡或者做侵袭迁移等实验。下图为预实验结果，X因素处理A细胞后与B细胞共培养，检测B细胞的迁移能力（同样用transwell小室完成迁移实验）。
图1. B细胞与X因素处理过的A细胞共培养，迁移能力显著降低。（技术问题导致图片添加后不清楚）
注意事项： 1、该实验绝对不能说明因素X处理的细胞A，通过外泌体来改变细胞B的生物学功能。而只能说明细胞B分泌的某种物质起了该作用，外泌体是其中的一种可能。 2、在共培养过程中，处理组和对照组的所有处理环节必须完全一致，因素X的处理必须在共培养前（A细胞接种于六孔板之前）完成。 3、Transwell小室膜的面积尽量买大一点的，也就是说最好是安放在6孔板当中甚至是更大膜面积的小室，这样才能保证有足够量的共培养后的细胞B做进一步功能学研究，具体的选择可以参考附件二。至于买什么牌子的Transwell看个人喜好。 4、研究细胞A分泌的某种物质对细胞B的影响，则将细胞A接种在下室（例如6孔板中）而将细胞B接种在上室（Transwell小室）。 5、接下来要证明上述共培养过程中是否是A细胞分泌的exosome在调节B细胞的功能过程中起了作用，我需要进一步完善实验，主要分为三部分，其一是研究A细胞分泌的外泌体是否可以主动进入细胞B，其二是研究在共培养过程中阻断A细胞外泌体的分泌或者B细胞外泌体的摄取是否能够阻断A细胞分泌某种物质降低B细胞迁移能力这一过程。最后就是分别抽提X因素处理的A细胞和对照组细胞的外泌体，直接加入到B细胞供，共孵育后检测其迁移等功能的改变（也就是平时大家用到较多的方法）。
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发表于 2015-5-18 23:19:30
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