再次分享Transwell小室在exo研究中的应用

惜名

落叶知秋在本板块分享了Transwell小室的应用，http://www.exosome.com.cn/forum. ... =214&extra=page%3D1
本人在此基础上进行了预实验，得到了较好结果，现分享如下

目的：查看A细胞是否通过分泌exo导致HUVEC（内皮细胞）高表达黏附因子（VCAM-1、ICAM-1等）
背景：A细胞为一种免疫细胞，其可以分泌促炎因子（TNF-α等）导致HUVEC高表达VCAM，但是否也可以分泌exo完成这一作用尚不清楚。
设计：6孔板正常培养HUVEC（贴壁细胞），达到一定密度后，于孔中放入Transwell小室，在小室中培养A细胞（悬浮生长），A细胞培养基加/不加GW4869。共培养8小时后，弃小室中A细胞，收6孔板中HUVEC，提mRNA检测VCAM-1和ICAM-1。
结果：1、和对照相比，A细胞共培养可以导致HUVEC分泌VCAM显著升高；2、加入GW4869后，A细胞共培养导致的VCAM升高较不加GW4869下降，但仍然高于对照组（好绕）。
结论：A细胞可以通过分泌“某些东西”导致HUVEC高表达黏附因子，这个“某些东西”包括exosome。


意义：该步实验能够证明A细胞的确可以通过exo参与HUVEC活动（共培养的方式），然后接下来提取A细胞分泌的exo直接加入培养基干预HUVEC得到一致的结果，然后做通路。整条思路就相对完整了。

惜名

第二种方法存在明显缺陷啊，该方法只能说明：A细胞分泌了“某些东西”至培养基中，“这些东西”可以导致B出现功能变化，但这和exosome有啥关系呢？
所以我觉得如果用第二种方法，也需要加一个GW4869，减少exosome分泌，如果能观察到“加GW4869组”和“不加GW4869组”B细胞的功能差异，则可以认为exosome
参与了这个作用。其实这样一来，和Transwell共培养很接近了。

P.S. 窃以为，大文章做到 GW4869是不能满足的，还需要给CD63加荧光信号，确认GW4869可以减少exosome分泌、并且B细胞摄取的荧光信号减少，才能真的证实exosome的确参与了A与B的功能作用。

发货33

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daryl1996

您好，对于AB细胞放置于小室还是6孔板，您的方法好像与原帖相反，请问这个影响大吗？我个人的理解是如果把受体细胞放在下面(6孔板），小室中细胞分泌因子会因为重力作用达到6孔板，而如果把受体细胞放于小室是不是能证明受体细胞能主动摄入分泌的因子呢？

zydmm118

请问楼主共培养一般不是分泌外泌体的细胞放在下室吗，这个放置在上下室有什么区别吗？还有如果检测蛋白变化以及增值侵袭这些变化应该是作用多长时间呢，谢谢啦

windowx

请问楼主，看A细胞分泌的外泌体对HUVEC的影响，为什么不是把A细胞种在下室，HUVEC种在小室中？

jy小虾

受益良多

127913abc

范范 发表于 2017-11-14 10:40
请问楼主共培养一般不是分泌外泌体的细胞放在下室吗，这个放置在上下室有什么区别吗？还有如果检测蛋白变化 ...

请问楼主得到上下室有什么区别了吗

范范

请问楼主共培养一般不是分泌外泌体的细胞放在下室吗，这个放置在上下室有什么区别吗？还有如果检测蛋白变化以及增值侵袭这些变化应该是作用多长时间呢，谢谢啦

落叶知秋

哈哈，惜命辛苦了。

scult1990

有没有参考文献？