用kit提的外泌体可否用于细胞/动物实验？

木瓜31

我想用试剂提取细胞上清外泌体，静脉注射到动物体内，不知道哪位战友有经验呢？求赐教~
1. 需要多少ml的细胞上清？  之前看到的文章或分享多是用超离法提取，用到的细胞上清基本多于70ml，如果用life的kit提取大概需要多少的上清呢？为经济及效率计，可以先简单超离再加kit吗？
2.如果按照蛋白定量，静脉注射小鼠需要多少ug的外泌体蛋白？看到有战友分享3~4ug（每周2次×4周），也看到有文献用到100ug（一次性）
3.有谁用荧光标记CD63-exo，追踪注射到体内的外泌体分布的情况吗？可否分享下经验？
4.提取到的外泌体，尽可能新鲜应用，但如果情况有变，怎么保存为宜（能够最大限度保持活性）？4度放3~5天有影响吗？

lczyld

惜名 发表于 2015-6-29 08:20
这么久没人回复，我来做个沙发吧。。。
1、kit提exo用上清量建议初始为10ml（SBI），还要根据你的细胞分泌 ...

前辈，您好！我也准备从细胞上清中提取外泌体，请问无外泌体血清在细胞培养中怎么用

惜名

wenzhouzsl 发表于 2015-6-29 08:52
惜名大师好，您提到“用Millipore的超滤过浓缩一下再加kit会省点钱”
我想问问，超滤管您用多少kDa的？超 ...

大师不敢当。。。业余搞科研，灌点水文章准备毕业了。。。
用100kd的，也是从Johnny版主那里借鉴的方法。用15ml上清超滤后可酌情剩0.5至数毫升。然后再加SBI试剂，后续方法不变。
这个应该没有损失吧，因为超滤管不会把exo虑走的。这样做需要考虑的问题是：液体浓缩后在用kit提取，会不会增加蛋白沉淀、因此污染最终所得的exo？。。。

wenzhouzsl

惜名 发表于 2015-6-29 08:20
这么久没人回复，我来做个沙发吧。。。
1、kit提exo用上清量建议初始为10ml（SBI），还要根据你的细胞分泌 ...

惜名大师好，您提到“用Millipore的超滤过浓缩一下再加kit会省点钱”
我想问问，超滤管您用多少kDa的？超滤之后再用kit，不会有太多损失吧？我那个细胞产生的exo很少呢。
谢谢

惜名

这么久没人回复，我来做个沙发吧。。。
1、kit提exo用上清量建议初始为10ml（SBI），还要根据你的细胞分泌能力摸索、调整上清量；简单超离+kit，没听说过，但是我用Millipore的超滤过浓缩一下再加kit会省点钱。。。
2、这个你自己看着办吧，最好自己摸浓度。或者在体外做一下，观察到现象后，再估计体内的浓度。文献报道差异太大。。。
3、体内追踪可以用DiR标记，详见参考文献1.我也看到过用GFP标记CD63，然后拍共聚焦，似乎操作难度大很多。。。
4、目前越来越多的文献关注exo表面蛋白的生物学作用，我个人经验，如果需要放置24小时以上，我都会转移至-80或-40，因为这样才能最大程度保存蛋白活性。

参考文献
1.Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles 2015.