中山大学：MSC-sEV减轻2型先天淋巴细胞相关过敏性气道炎症

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中山大学：人间充质干细胞分泌的小细胞外囊泡减轻2型先天性淋巴细胞相关的过敏性气道炎症

2型先天性淋巴细胞（ILC2）在过敏性疾病中起着关键的作用。来自中山大学附属第一医院付清玲课题组的研究人员开发了一种新的可扩展方法用于分离间充质干细胞分泌的小细胞外囊泡（MSC-sEV），确定了MSC-sEV对小鼠ILC2相关的过敏性气道炎症的治疗作用，并鉴定了miR-146a-5p在其中的潜在治疗作用。该研究发表于JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES杂志上。

哮喘和过敏性鼻炎的特征是气道高反应性（AHR）、气道炎症和气道重塑，已成为全球关注的重要公共卫生问题。气道炎症的发病与气道上皮的损伤、T细胞和树突状细胞（DC）的失衡有关。传统意义上，Th2细胞被认为是驱动过敏性炎症疾病的主要因素。据报道2型先天性淋巴细胞（ILC2）极大地促进了2型过敏性气道炎症的发生和维持。ILC2是重要的先天免疫细胞，在上皮细胞分泌的细胞因子（如IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素）的作用下会产生IL-5、IL-9和IL-13。该研究团队此前研究发现，哮喘和过敏性鼻炎患者外周血ILC2比例显著增加。此外，严重哮喘病的ILC2频率与持续性肺嗜酸性粒细胞增多相关。因此，ILC2s是抑制过敏性气道炎症的新的有希望的目标。间充质干细胞（MSCs）是能够分化为三种类型的间充质细胞的多能细胞，可有效调节T细胞表型以及DC细胞分化和成熟，并有助于改善过敏性气道炎症，尤其是对糖皮质激素不敏感的以中性粒细胞为主的哮喘症状。

据报道，MSC通过细胞间接触、分泌一些可溶性因子和外泌体发挥免疫调节作用。外泌体是通过多泡体与细胞膜融合而释放的细胞外囊泡，直径约为30-150nm，并包含大量的功能成分，例如microRNA（miRNA）和蛋白质。比如，源自MSC的外泌体可以实现与其来源MSC相似的治疗作用。更重要的是，与全细胞疗法相比，由MSC释放的外泌体具有显著的优势，例如免疫原性低、易于保存和生物安全性高。因此，MSC外泌体有希望用于某些疾病的无细胞治疗剂。

迄今为止，只有两项研究检测了源自MSC的小细胞外囊泡（MSC-sEV）对过敏性气道炎症的治疗作用，发现MSC-sEV显著降低了小鼠的炎症浸润、气道重塑和AHR。尽管这些研究确定了MSC-sEV在变应性气道炎症中的作用，但MSC-sEV减轻变应性气道炎症的机制仍然未知。特别是，MSC-sEV对ILC2的作用及其机制仍不清楚。鉴于ILC2在变应性气道炎症中的关键作用，研究团队猜测ILC2的激活是变应性气道炎症中MSC-sEV的潜在新治疗靶标。此外，研究团队猜测IL-33引起的过敏性炎症中ILC2的存活、扩增和维持可以通过细胞外囊泡里的miRNA来调节。因此，MSC-sEV在过敏性气道炎症中的治疗作用可能归因于小细胞外囊泡 miRNA。然而，大规模生产用于临床应用的MSC外泌体需要稳定可靠的分离方法。尽管差异超速离心法仍然是分离外泌体的最常用方法，但在很大程度上受到效率低、异质性高和不可扩展性等缺点的限制。

据报道，阴离子交换层析可实现骨髓来源的MSC（BM-MSC）释放的生物活性外泌体的分离。然而，使用BM-MSC产生治疗性外泌体的局限性在于细胞在体外广泛扩增后将迅速衰老，从而不可能持续性地分离出用于临床治疗的均质MSC外泌体。研究团队此前已经证明，诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的MSC在表型和功能上类似于成体MSC，并且表现出更高的增殖潜力、更长的寿命、更强的免疫特性和更低的异质性，是大规模制备外泌体的理想细胞来源。因此，研究团队首先优化了一种阴离子交换色谱法用于纯化源自iPSC-MSC的外泌体，根据MISEV 2018的命名方式，分离出的外泌体被称为小细胞外囊泡（sEV）。

在这项研究里，研究人员开发了一种用于交换MSC-sEV的阴离子交换色谱的标准化可扩展方案，并在变应性鼻炎患者和小鼠ILC2主导型哮喘模型中研究MSC-sEV对ILC2功能的影响。MSC-sEV通过其大小、形态学和特异性标记物被确认表征。研究人员使用流式细胞仪和人类细胞因子抗体芯片，发现MSC-sEV显著抑制了人ILC2的功能。同样，全身性施用MSC-sEV表现出对ILC2水平的抑制、肺部炎症细胞浸润和粘液产生、Th2细胞因子水平的降低以及在小鼠哮喘模型中气道高反应性的减轻。

研究人员通过RNA测序，发现miR-146a-5p是介导MSC-sEV的上述作用的候选物。进一步，研究人员揭示ILC2对MSC-sEV的吸收作用、体外实验里MSC-sEV中miR-146a-5p向ILC2s的转移、以及小鼠模型中对MSC-sEV对ILC2s的影响。总之，这项研究证明了MSC-sEV通过miR-146a-5p减轻ILC2介导的过敏性气道炎症，这表明MSC-sEV可能是一种新型的无细胞治疗过敏性疾病的策略。

图：通过阴离子交换色谱法分离sEV

参考文献：Fang SB, Zhang HY, Wang C, He BX, Liu XQ, Meng XC, Peng YQ, Xu ZB, Fan XL, Wu ZJ, Chen D, Zheng L, Zheng SG, Fu QL. Small extracellular vesicles derived from human mesenchymal stromal cells prevent group 2 innate lymphoid cell-dominant allergic airway inflammation through delivery of miR-146a-5p. J Extracell Vesicles. 2020 Feb 10;9(1):1723260.