求助：外泌体的分离纯化得到的DLS数据接近1000nm（超离）

nanobio

各位大牛，请教一下，如题。我用的是肿瘤细胞上清，3-5个T75 的培养瓶，无血清培养基培养24-48h，收集上清（50ml左右）后，采用梯度离心法。具体步骤是：300g 4℃ 10min，2000g 4℃ 30min，10000g 4℃ 30min都是吸走上清，弃沉淀，然后100000g离心70min，1mlPBS重悬后过0.22um的滤膜，再次100000g离心70min，沉淀用50ulPBS重悬。取30ul用PBS稀释至3ml，粒度仪检测粒径约1000nm，小峰看不到。以前用这个方法做出来的是84nm，不知道问题出在哪里了。感觉有点问题的是10000g和第一次100000g离心没有见到肉眼可见的沉淀。请问这是怎么回事？谢谢各位！

amelinda

各位大牛，请教一下，如题。我用的是肿瘤细胞上清，3-5个T75 的培养瓶，双色球走势图
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amelinda

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澳洲幸运20

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小田不甜

楼主后面找到问题的原因了吗？我最近也在提外泌体，除了300g 10min可以看见沉淀外，接下来的离心都无肉眼可见的沉淀，最后测粒径峰形很差，PDI达到0.7左右，不知道是怎么回事，可以交流一下吗？

15511958250

赵静 发表于 2022-5-17 21:53
请问楼主是怎么处理DLS得到的数据？
我检测的是植物类外泌体纳米囊泡，样品稀释100倍，数据显示平均粒径是4 ...

得到外泌体后是不是还要过滤一下，我们都用两种0.22,  0.1  的滤器。

赵静

zhangchao 发表于 2020-8-20 10:58
1、1mlPBS重悬后过0.22um的滤膜，再次100000g离心70min。请问是用1ml的管直接100000g离心么？还是大的离心 ...

我一般将重悬液加到超离管中，按照仪器或离心管使用要求，添加PBS，超离后根据上清液的量加PBS重悬分装到多个小的离心管中冻存备用

赵静

请问楼主是怎么处理DLS得到的数据？
我检测的是植物类外泌体纳米囊泡，样品稀释100倍，数据显示平均粒径是437nm，但粒径大小分布范围为28-50nm，这是什么原因呢？

WinterBlinder

学习学习

nanobio

谢谢回复！ 关于您的问题：1. 我们用的贝克曼的超速离心机，用的344058离心管，重悬后，加满液体（这是仪器要求）。重悬和离心都是在超离管中进行的。
2. 我以前用过两瓶巨噬细胞（T75）,得到的外泌体能看到沉淀。虽然以前的液体多，但是细胞数量没有现在多，我看文献说外泌体的数量多少是和细胞数量和类型有关的，所以感觉上清液的体积不是太重要。当然thery C 2006年的protocol说至少用7个10cm的皿，生长面积约55*7 cm2 。看来是需要增加细胞上清的体积。

zhangchao

1、1mlPBS重悬后过0.22um的滤膜，再次100000g离心70min。请问是用1ml的管直接100000g离心么？还是大的离心管里边只有1ml液体，具体是怎么操作的呢？
2、没有沉淀的原因可能是上清较少。我一般是3个50ml，一起离心。