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本帖最后由 hzangs 于 2015-10-26 20:30 编辑
从事exosomes相关的课题已经一年半了，期间走了不少弯路，尝试过各种各样的分离方法，最后为我们实验室建立了以超速离心为基础的分离鉴定exosomes的成套方法。
最近有些从事exosomes相关研究的新朋友在问，使用试剂盒分离exosomes，发paper的时候杂志认不认。这确实是一个很头疼的问题，既然有人开始问了，那我就略微整理一下自己的一些看法与大家分享。我使用过的分离方法主要有三种，分别是life试剂盒（与SBI类似，PEG-base的沉淀法）、凝胶排阻层析和超速离心分离。凝胶排阻层析与超速离心的对比已经在我之前的帖子中有过总结，在这里不再赘述。这次主要是想和大家分享讨论一下 类似于life、SBI等沉淀分离exosomes的方法存在的一些问题。目前我仅使用过life的exosomes沉淀分离的试剂盒，所以在这里只以life的试剂盒为例。
我认为life这种沉淀法的试剂盒主要是一下几方面问题：
1、试剂盒沉淀法收到的沉淀量很大。相同体积的培液，目测估计 试剂盒沉淀法通常是超离分离法沉淀量的十几倍甚至上百倍。（有朋友提出质疑“可能是超速离心 2小时 分离时培液中还有exosomes没有沉淀下来，因此是超离分离不充分而不是试剂盒沉淀分离的问题”，针对这个假设，我之前是做过实验的，110,000g超速离心70min 的培液，取上清继续超离70min，是看不到任何沉淀的，说明超速离心分离是比较充分的）
2、试剂盒沉淀法沉淀中蛋白含量十分高。相同体积的培液，试剂盒沉淀通常收到的蛋白量会是超离分离法得到的沉淀量的几十倍。（有朋友提出质疑“沉淀未经PBS洗涤，所有可能有杂蛋白，洗涤后再用试剂盒沉淀，沉淀量看上去会小”，这个我认为洗涤之后再用试剂盒沉淀下来，确定 粒子数/微克蛋白 的值 与超速离心分离的结果作对比 才有参考意义。其他方法或多或少都有主观臆断的情况）
3、文献报道显示，试剂盒沉淀法通过粒子浓度检测 单位用 粒子数/微克蛋白时，试剂盒沉淀法每微克蛋白所含粒子数低于超离分离法很多。（这是说明试剂盒沉淀法的沉淀中带有大量杂蛋白的一个证据）
4、我使用试剂盒沉淀得到的所谓的exosomes和超离的到的exosomes同时分别处理细胞，用于试验。试剂盒沉淀得到的所谓exosomes出现了假阳性结果。（按照我的数据分析，这说明试剂盒沉淀法中的杂蛋白确实会影响表型，恰恰支持了后文中reviewer提出的质疑）
有朋友说，试剂盒做出来的有问题是因为操作不熟练。但是我想说，这个试剂盒的要求很简单，不可能是操作问题。而且，如果一个试剂盒都要非常精准的操作，还要反复练习，那这个试剂盒还有什么意义呢？这个观点我真的不敢苟同。
另外，惜名师兄的案例也已经说明，现在使用试剂盒沉淀分离exosomes是有可能受到reviewer的质疑的。该案例中reviewer直指一个致命的问题：试剂盒沉淀得到的exosomes样品 其粒子数/微克蛋白要明显低于超速离心法，说明沉淀中有大量的蛋白不是exosomes中的，那么使用这种exosomes样品处理细胞带来的表型，有可能是杂蛋白引起的，所以实验不严谨。这篇paper（Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015）里对沉淀法和凝胶排阻以及超离分离法的对比，确实证实沉淀法中存在大量的杂蛋白。
综合上面一些我遇到的和坛友遇到的问题，可以看出，现在试剂盒沉淀法还存在非常多的问题。在后期投稿时还是很可能被argue的。因此 我认为大家在前期制备exosomes样品是还是要慎重选择分离方法，尽可能使用超速离心的方法，而慎重选择试剂盒提供的沉淀法。
（今天事情比较多，后面我会逐渐完善我使用life的kit的时候 遇到的上面几方面问题）
非常愿意和大家对此事进行讨论 
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|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2015-10-26 20:18:54
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楼主
发表于 2016-4-25 23:27:10
