有点不是很理解

liuhaoisboy

至少70ml的条件培养基（至少7个10cm的培养皿 和 20个15cm的培养皿）。10cm的培养皿不是就有10ml培基了，7个就是70ml，为什么还要and 20个15ml的培养皿呢？

还是我理解有误。

大家制备提取外泌体的细胞上清液时，一般用多少细胞培养，培养多长时间？ 我看文献，有48小时的，有72小时的。还有细胞培养达到80-90%的汇合程度的。

请论坛的大神，答疑解惑。谢谢啦~

hzangs

yy8651 发表于 2015-12-13 14:42
只是担心一直这样养下去会影响细胞，毕竟有文献说超离的培液会对细胞增殖有些影响，长期用的话担心有问题 ...

一篇nature的子刊  paper method里说 用2ml CM 超离分离exosome 可以看到沉淀。   信不？

paper不能尽信， nature的子刊 尚且如此， 更何况一些小paper…  很多时候 paper的结果都是值得商榷的，自己实验 验证之后 再决定如何去做。

我样的tumor cell 超离处理的培养基培养 这些cell，cell的状态很好， 而且lyden那边也是这么做的。 这些结果也仅限于我的cell， 所以在回复里 我也写的很清楚的， 我所描述的是我的方法。 我的方法能不能适用于你的细胞， 那还是需要你自己去尝试的。

hzangs

liuhaoisboy 发表于 2015-12-12 11:48
也有这个疑问。看文献没有提到要间隔培养的。

起始培养的细胞量跟你自己的细胞系生长性质有关， 我是使用的细胞 一般1个15cm dish 长满大约是1200W 细胞， 3天大约可以从50%长到95%  所以我最开始会铺大约500W-600W细胞。 你也可以根据自己的细胞来铺板。 因为我的细胞系 正常情况下就是3天传代一次 换配液，所以我加入配液的量也没有什么变化。
因为tumorcell 很坚强的，所以 配液一直使用超离去除exosome的配液，对细胞生长没有什么影响。
其实吧 一般文献里都不会给你提及这些细节的。很多时候 paper里的protocol 都会故意隐去一些关键细节  让人很无奈……  这个细节是去过lyden实验室的朋友告诉我的

hzangs

翻译一下：使用足够量的细胞来产生至少70ml的培养液（最少7个10cm dish 最多可以到20个 15cm dish）；通常情况下，纯化产量会随着其实培液体积的增大而增加，所以从大体积的培养液里纯化exosome会更好。

7个10cm dish 基本就是70ml  所以这段话里说  至少使用70ml培液。 而由于超离机器的限制，所以一般20个15cm dish的培液  是上限，再多的培液  一次就处理不完了。

通常情况下根据自己的实验具体安排培养时间。 我做tumor cell的 细胞比较坚强  72小时 不换液  没问题的。 所以我都是72小时。  我一般是50%的密度铺板，然后3天长到约90%-95% 然后收培液 同时传细胞重新到50% 开始进行下一个72小时培养。

希望可以帮到你

effiezhang66

Johnny 发表于 2015-12-25 22:00
做蛋白组学的话，一定要用经典超速离心的方法。其它的实验都相对好点，各种鉴定只要能出结果，功能实验只 ...

您说的太中肯太好了，谢谢大牛！！！

effiezhang66

还想请教朋友，有没有好的办法可以提高超离的效率呢？因为用的不是细胞系，实在是太费细胞了，5555

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 21:20
那现在大家难道只能用盒子提出的EV做形态学实验和鉴定吗？功能学的刺激或者蛋白分析是不是还是要超离呢？ ...

大牛谈不上…… 还请不要这么称呼。

论坛里 也有朋友 使用kit分离exsome 去做功能和蛋白分析。 但是之前惜名的师兄用kit分离的exsome做实验，投paper的时候 被argue了， 但是后来他们用超离的方法去重复实验，结果基本和kit的结果是一致的， 目前也有朋友说实验去验证过 沉淀试剂盒沉淀中杂蛋白量并不大……   众说纷纭。
所以 安全起见，现在还是用超离最靠谱，超离也是目前主流的几个CNS和CNS子刊 paper 一直在用而且是唯一在用的方法。

effiezhang66

hzangs 发表于 2015-12-25 21:15
你的方法 复旦大学貌似有同学用过，并且去打了质谱。

考虑到你使用试剂盒沉淀  在用PBS洗一次，再超离，  ...

那现在大家难道只能用盒子提出的EV做形态学实验和鉴定吗？功能学的刺激或者蛋白分析是不是还是要超离呢？谢谢大牛

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 21:07
您好，因为我的细胞量特别有限，我的理解是同样多细胞盒子的提取效率可能更高，所以想尽可能地洗掉盒子提 ...

你的方法 复旦大学貌似有同学用过，并且去打了质谱。

考虑到你使用试剂盒沉淀  在用PBS洗一次，再超离， 应该是可以去掉一部分杂蛋白的。 但是个人建议，如果是后续实验去打质谱，  干脆点  什么kit都不要用， 就用超离 ， 起码反映的结果 是最靠谱的，也是最不容易被argue的。

effiezhang66

Izon 发表于 2015-12-25 19:15
既然知道沉淀类的试剂盒会带来大量的杂蛋白，还想用这样的分离方法提取的样品做蛋白组学？！，靠谱吗？"有 ...

您好，因为我的细胞量特别有限，我的理解是同样多细胞盒子的提取效率可能更高，所以想尽可能地洗掉盒子提取出EV里的杂蛋白，这样既节约细胞，又可以去除杂蛋白~

effiezhang66

Johnny 发表于 2015-12-25 18:45
既然可以用完全超离得到exosome，为什么还要用试剂盒呢？

如果你像图个试剂盒的方便的话，你倒是可以反 ...

因为感觉盒子提出来的的确比超离提出来的多太多，所以考虑一方面盒子的提取效率是不是相对高一点但同时杂蛋白比例比较多，所以想通过提完后再溶解于PBS用超离尽可能洗掉杂蛋白。因为用的不是细胞系所以细胞比较珍贵才想到这种方法，想听听大牛意见~

effiezhang66

hzangs 发表于 2015-12-25 15:57
TEM 应该没问题。  后面的蛋白组学分析，没有用这些方法尝试过，所以没办法评价。 ...

谢谢！！！

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 14:10
@hzangs@Johnny，严重同意，相信文章里那么点CM就能见沉淀的，满满血泪史。求问大牛们，为了节省细胞，提高 ...

TEM 应该没问题。  后面的蛋白组学分析，没有用这些方法尝试过，所以没办法评价。