本帖最后由 hzangs 于 2017-8-17 11:06 编辑
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论文原文在本帖二楼。
读完这篇文章，你可以用一百块钱的材料自己制作总价值十几万的SBI沉淀试剂盒
相信大家一直很纠结于外泌体的分离纯化。超速离心一轮复一轮，简直是在磨灭青春；沉淀试剂盒几十毫升动辄报价几千甚至上万，看着就让人肉疼，用着简直心如刀绞啊，主要成分为PEG等高聚物的溶液加个包装成本不过十几块钱却要卖到几千块，实在让人无奈啊。现在你不需要再纠结了，4月12日发表的sci rep上的一篇方法学文章为大家带来了曙光。来自佛罗里达州立大学的研究者为大家解析了PEG聚沉法分离外泌体的关键步骤，并且优化了一整套分离方法。
PEG聚沉在过去的几十年里一直是富集病毒的经典方法，而外泌体的大小和部分理化性质又与病毒及其相似，这也就是的PEG聚沉分离外泌体成为了可能，在外泌体研究突飞猛进的这两三年里，一些公司也开发了依据高分子聚合物聚沉原理的沉淀试剂盒，但是售价却高的惊人。笔者相信，近期发表的这篇文章将会大大降低大家使用沉淀法的成本。
文章摘要：细胞分泌的胞外囊泡，例如外泌体，最初被认为是细胞用来排除胞内废物的方式，现在被公认在多种健康或者疾病过程中发挥作用。虽然外泌体在体液中大量存在，但是由于其理化特性，纯化外泌体还是面临着诸多困难。近段时间来，容易操作的商业化试剂盒被很多人用于分离外泌体，但由于其低纯度和高污染量一直制约着它们的推广和应用。本文中，我们介绍了一种纯化外泌体和其他胞外囊泡的方法，该方法由过去利用聚乙二醇富集病毒的方法发展而来。这个技术被我们称为—ExtraPEG，该方法可以从大体积的培养液中通过低速离心配合小体积的超速离心纯化从而快速和廉价的富集外泌体。该方法富集的外泌体可以用于后续的外泌体定量以及蛋白和RNA的定量分析，蛋白组学和测序分析，这也证明该方法可以用于生物标志物的开发和未来诊断应用中。同时，进一步的实验证明该方法分离得到的囊泡的生物活性并未受到影响。ExtraPEG方法通过简易改变即可适用于不同囊泡组分的富集，也可以也用来作为进一步纯化前的高效浓缩过程。这一方法可适用于多种多样的体液中囊泡的分离，分离得到的囊泡可用于各种各样的后续研究。 电镜图： 可见，8%PEG联合小体系超离纯化即可获得非常漂亮的电竞图片。
粒子浓度和粒径分布分析：
可以看到媲美蔗糖垫超速离心的粒子浓度和粒径分布。
下面笔者将解析一下作者提供的试剂配方和实验方法： Polyethyleneglycol with Mn (number average molecular weight) of 6000 (Sigma, 81260)wascombined with filtered water (18.3 Mega-ohm system; ELGA Purelab flexpurification system) and sodiumchloride (1 M) to make a two-fold concentrated(2x) stock solution. 适量聚乙二醇（Mn平均分子质量=6000）溶解于纯水中同时加入氯化钠，使氯化钠浓度为1M。从而得到2倍浓度的储存液。 （编者注：将16g聚乙二醇溶解于水中，在加入5.844g氯化钠，定容至100ml即为储存液。使用时，1ml培液加入1ml上述储存液即可）
Vesicle-containingmedium from cell culture was centrifuged at500 g for five minutes followed by 2,000 g for thirty minutes at 4 °C to removecellular debris and largeapoptotic bodies. Once centrifuged, the media was added to an equal volume of a2. PEG solution at 4 °C, toachieve a desired final PEG concentration (5–15%). After the 2. PEG solutionwas added, samples were mixedthoroughly by inversion, and incubated at 4 °C overnight (at least 12 hrs). Thenext day, samples were centrifuged in atabletop centrifuge at maximum speed (Eppendorf, model 5810 R using an S-4-104swing bucket rotor; 3,214 g)for 1 hour at 4 °C. Conical tubes were then decanted, and allowed to drain forfive minutes, tapping occasionally toremove excess PEG. The resulting pellet was suspended in 50–500 μL ofparticle-free PBS (pH 7.4). Subsets of sampleswere then either stored at − 80, or further purified by PEG-precipitation for a secondtime using a lowerconcentration of PEG, or by re-suspending in PBS and centrifuging at 100,000 gto wash and re-pellet thevesicles. For the former group of samples, the pellet resulting from theprimary PEG treatment was diluted in 5 mLPBS. An equal volume of 2. PEG solution was added, this time to a lower finalPEG concentration of 5%. The lattersamples were suspended in 1 mL PBS and ultracentrifuged (100,000 g) for 70minutes to wash the particles ofcontaminating protein and PEG. All samples were finally resuspended inparticle-free PBS, by shaking at roomtemperature for up to 30 minutes. 编者适当解释上述英文不再做翻译。500g和2000g离心去掉细胞碎片。加入1倍体积上述PEG溶液，4°过夜孵育。常规离心机最高转速1h后收集沉淀。沉淀重悬与PBS，使用略低浓度PEG再次聚沉或通过小体系超速离心纯化外泌体。
到此结束，文章解析了PEG聚沉分离外泌体的方法。笔者做了一个粗略的计算，如果使用国产的生工出品PEG6000，生工官网报价为500g/76元。大约可以配置16%PEG溶液3125mL。相当于62.5瓶50mL装Life沉淀试剂盒，12.5瓶50mL SBI沉淀试剂盒。而即使使用文章作者建议的sigma的PEG6000 官网价格也仅需要1kg/756.99元。 沉淀法分离外泌体从此不再是试剂盒的天下！使用沉淀法的朋友们也可以告别割肉的时代，开启一个新纪元。
文献全文见论坛相关帖。
沉淀试剂盒相关专利书请见：http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO2&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&l=50&co1=AND&d=PTXT&s1=%22US+9,005,888+B2%22&OS=
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|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2016-4-15 23:12:52
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来自 403#
楼主
发表于 2016-4-18 20:01:12
