血清exosome蛋白SDS-PAGE电泳结果求助

丝瓜

超离+蔗糖垫提取血清exosome后电泳考马斯亮蓝后的结果~~



有专业人士帮忙分析下么？~
红笔圈出的这一条亮亮的这个很难说是什么呀，这样的图怎么判断外泌体的蛋白纯度呢？

18940258208

求助！关于exosome蛋白的western blot，我做的是CD63的鉴定，用的是Qiagen厂家的exoEasy Maxi kit试剂盒提取的细胞上清15ml的外泌体（共6个不同时间点的样本），最后溶于500ul XE buffer。前后一共做了6次WB，起初是没有用裂解液，配的10%胶，直接取20ul加相应的loading buffer，100度变性后上样，然后出来的条带是连续一条直线，之后改了各种试剂及条件，仍是一条线，我怕是自己的技术问题，同时期同条件下还跑了以前剩余的普通蛋白标本，杂的是GAPDH，跑出来的泳道间隔都没问题，证实我的技术还行。于是在最后一次加了裂解液（MPER+PMSF）后，显影竟然是白板，Oh MY GOD，我想死的心都有了。也翻阅了好多文献，但是都不是说的很具体详细。寻寻觅觅终于找到组织了，求助各位大神

子非鱼

微泡biomarker 发表于 2016-7-4 21:04
我也做血清但是和你的图差别好大，我们为了减少上样量都用银染，如果你的marker 是在 Alb or igG 那有可能 ...

微泡，你跑出来血清exosome是什么样子的？方不方便看看微泡的考染图或银染图图 啊？

子非鱼

我是想问，血清exosome跑出来都是这么几条带吗？还是说这几条带其实是血清里的高丰度蛋白没清洗干净遗留下来的 啊？也做这方面，困惑ing.....
微泡，你跑出来血清exosome是什么样子的？

wjy

丝瓜 发表于 2016-7-25 21:52
红线是70，上面那条是100.应该是70-100之间的，我跑过血清的，白蛋白的位置跟这个也不一样~~
现在已经把 ...

哇这么轻易就可以打质谱啊？能弱弱的问一句，你们是自己实验室有质谱还是拿去外面测质谱

丝瓜

wjy 发表于 2016-7-24 15:14
你红线部分的分子量多大，要是70KD可能是血清的白蛋白。

红线是70，上面那条是100.应该是70-100之间的，我跑过血清的，白蛋白的位置跟这个也不一样~~
现在已经把那块抠出来打质谱鉴定了，等鉴定结果

wjy

你红线部分的分子量多大，要是70KD可能是血清的白蛋白。

丝瓜

微泡biomarker 发表于 2016-7-4 21:04
我也做血清但是和你的图差别好大，我们为了减少上样量都用银染，如果你的marker 是在 Alb or igG 那有可能 ...

是嘛？我做了几遍，红线部分一直都是比较浓的。看过ALb和IGg的分子量都不是那个位置。不知道你有没有做过某些所谓的阴性蛋白，就是说exosome没有得maker，跑出来就说明不纯的那些。不过血清的和细胞的有可比性么？

丝瓜

Johnny 发表于 2016-7-4 18:23
需要抗体杂一下几个exosome marker

经典的maker都没什么问题~~可是不知道这个纯度怎么样

微泡biomarker

我也做血清但是和你的图差别好大，我们为了减少上样量都用银染，如果你的marker 是在 Alb or igG 那有可能就是呢。