感觉电镜做废了

pytruth

小弟刚开始做细胞上清外泌体，最近老板跟锐博挺熟的，让试试锐博的exosome提取试剂，我用9ml细胞培液提出来exosome，肉眼不可见，用的40ulPBS重悬，但测了蛋白浓度能到2ug/ul，NTA检测峰值在190多，不知道正常吗？电镜制样采取牛人hzangs的方法，请一个师兄帮我染的，吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟上机，
镜下发现铜网的膜破了，几乎就没找到像样的外泌体，不知道是不是因为浓度太高了？电镜图见下，请各位牛人帮小弟看看都是什么东西？

hunxionfan

铜网上的膜也破了，我的超离血清得到的，等体积重悬了沉淀，10微升滴铜网，发现电镜下也破了，老师建议我稀释

IPromise

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sunshow

我提的是血浆的外泌体，也发生同样的事，杂蛋白太多，膜破了。不知道也没有办法先去除高丰度的蛋白质，再提外泌体会不会好一点。

yanzi_sjtu

我之前也做过两次铜网破裂，后来稀释了大概三四十倍，就可以了

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-18 09:55
你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的

好的，谢谢！

下里巴人

感谢分享！

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-18 09:36
好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？ ...

你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-16 20:00
粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。 ...

好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 17:28
还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？
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粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。但是如果可以结合NTA或者流式荧光标记囊泡再检测数目  这个比值的意义可能会更好一些。