外泌体处理细胞

向荣y

有没有做外泌体处理细胞的？一般设置什么样的浓度梯度啊？

惜名

梦想照进现实 发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读，谢谢！

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章，你仔细去找找，大都能找到一些剂量。

惜名

kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主，请指导下，PBS-exo处理细胞，你一般让它们共同孵育多久呢？按小时算，还是按天算？ ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
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如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用，那么时间应该是很快的，只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达，数小时就可以了。如果做蛋白，那就得16-24小时。
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如果你推测exo是通过里面的miRNA作用，那么时间就得参照转染miRNA的了，例如，我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。

惜名

ffp1988 发表于 2015-4-18 10:09
您所说的10ug/ml是指？？   外泌体的浓度？  怎么测出来的？

10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为外泌体无法用Nano或电镜测浓度（或粒子数），文献多用蛋白量来间接反应外泌体浓度。
譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。
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这里还有一个问题，10ug/ml的浓度只是相对你的实验体系而言的，因为目前认为不同的提取方法会导致exo纯度不一。例如有人认为kit提取的exo含有杂蛋白，这无疑会增加裂解后测得的蛋白浓度，因此使得不同提取方法之间的“外泌体浓度”没有可比性。
梯度密度离心法得到的exo或许目前认为是最纯的。

惜名

kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主，完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验 每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的蛋白，供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液，每ul约0.2ug。

kadak007

丁倩倩 发表于 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低

惜名在5楼回复时写到：“譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。”
仔细读完后，感觉他还是分两步走的，同时提2批等量的exo，1批裂解后测浓度；明确浓度后，另一批处理细胞。

丁倩倩

我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为是提取试剂盒中携带的试剂毒性），我之前做过浓度梯度，现在一般都用10ug/ml

惜名

用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓度。
我个人经验，4ml上清提取的外泌体(DC来源)，用200-400ul PBS重悬，然后用100ul干预一个孔（6孔板，HUVEC），是可以得到阳性结果的。

ffp1988

丁倩倩 发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

您所说的10ug/ml是指？？   外泌体的浓度？  怎么测出来的？

ffp1988

您讲的非常详细，我在想如果exo被蛋白裂解液裂解后在取处理别的细胞，还能不能被摄取？
还是把提取的exo平分成两组，一组测浓度，一组做实验？？？？

丁倩倩

惜名师哥已经说得很详细了，你做干预的话不用裂解，直接用提取的exosome用BCA（或其他方法）测浓度就好，建议也是先做个浓度梯度

huan1989111007

惜名 发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为 ...

非常详细，谢谢....

向荣y

惜名 发表于 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓 ...

多谢惜名！！我用的间充质干细胞外体，180ML上清重悬到1.2ml的PBS中，加到种有肿瘤细胞的96孔板里，做了四个梯度（以外体的体积为变量的），测的MTT结过飘忽不定，不知道是MTT实验本身的问题还是什么呢 好纠结！

hereissyk

好贴，顶一下