超速离心步骤问题

范范 · 发表于 2017-8-26 15:46:56

请问大家为什么2006年里的那个protocol建议超速离心两次啊，我可不可以只离心一次但是延长时间呢，第一次离心之后可以看到管壁的小白点，但是再用PBS重悬合并后超离就看不到了，而且western也鉴定不出来，有没有相关文献参考呢，谢谢！

hzangs · 发表于 2017-8-28 14:47:03

离心两次是为了用PBS洗掉沉淀里的部分杂质

范范 · 发表于 2017-8-28 23:15:07

hzangs 发表于 2017-8-28 14:47
离心两次是为了用PBS洗掉沉淀里的部分杂质

谢谢hzangs大神解惑，不知道是因为用到的细胞上清量太少了还是饥饿培养时间不够，或者是因为离心后倒掉上清把沉淀给冲掉了，每次提出来外泌体蛋白定量几乎为零，电镜也只能看到很少类似外泌体的结构，心好累。。。

meiling · 发表于 2017-8-29 14:24:20

范范发表于 2017-8-28 23:15
谢谢hzangs大神解惑，不知道是因为用到的细胞上清量太少了还是饥饿培养时间不够，或者是因为离心后倒掉上 ...

你好请问你怎么做的蛋白定量？BCA法吗？

范范 · 发表于 2017-8-30 17:11:21

hzangs 发表于 2017-8-28 14:47
离心两次是为了用PBS洗掉沉淀里的部分杂质

Hzangs大神，我想请教一下如果在2006年那个经典的protocol超速离心之前加一步0.22um过滤步骤，是不是可以只用超离一次就可以呢？

范范 · 发表于 2017-8-30 17:12:38

meiling 发表于 2017-8-29 14:24
你好请问你怎么做的蛋白定量？BCA法吗？

是的，目前是这么做的，不知道外泌体有没有更好的测浓度的方法

XLJY · 发表于 2018-1-8 18:02:52

楼主请问你现在做得怎么样了呢？我也遇到了同样的问题做出来蛋白太少太少了

范范 · 发表于 2018-1-10 19:22:36

XLJY 发表于 2018-1-8 18:02
楼主请问你现在做得怎么样了呢？我也遇到了同样的问题做出来蛋白太少太少了
...

细胞上清的用量要足够，200ml差不多吧，最后用100-200ul重悬，还是可以提出来的

JKF · 发表于 2018-1-15 20:34:19

范范发表于 2017-8-30 17:11
Hzangs大神，我想请教一下如果在2006年那个经典的protocol超速离心之前加一步0.22um过滤步骤，是不是可以 ...

我觉得应该可以

外泌体小天使 · 发表于 2018-4-16 13:46:57

我的试验方案是离心两次（100000g/70min）,最后一次离心完了再过滤，因为我们这个离心机不在我们实验楼我还得走很长一段距离，最后过滤可以保证一个无菌的结果！！！！

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