Nature Protocols：组织中细胞外囊泡亚群的分离和鉴定

Johnny · 发表于 2021-3-1 20:36:54

本帖最后由 Johnny 于 2021-3-1 20:36 编辑

Nature Protocols：组织中细胞外囊泡亚群的分离和鉴定

细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的脂质双层膜结构。多数EV研究是通过使用细胞系或体液进行的，但是组织衍生EV的研究数量仍然有限。瑞典哥德堡大学的研究人员在Nature Protocols杂志（影响因子10.419）发文，提出了一种protocol，可直接从组织中分离出多达六个不同的EV亚群。

该方法包括对解离的组织进行酶处理，然后进行差速离心和密度梯度分离。分离的EV亚群的特征通过电子显微镜和RNA谱进行表征。此外，它们的蛋白质成分可以通过质谱、蛋白质印迹等确定。组织EV分离可以在22小时内完成，简化版本可以在8小时内完成。该protocol的大多数实验都使用了人类黑色素瘤组织，但可以应用于其他癌症和非癌组织。具有细胞培养和EV分离经验的研究人员可以采用该protocol。组织EV亚群分离和鉴定方法的概览为了分离包埋在细胞外基质中的EV，可通过结合使用剪切和酶消化将EV从组织结构中分离出来（步骤2-16）。EV分离通过使用差速离心，然后加碘克沙醇密度梯度（步骤25–39A）来进行。图2概述了分离组织来源的EV的方案的工作流程。

图1. 人结肠癌组织的代表性电子显微镜图片

图2. 组织来源的EV分离程序的示意图
简而言之，收集后，将组织保持在冰上的PBS中，然后立即处理以进行EV分离（步骤1）。先将其切成小块（~2×2×2mm），再加胶原酶D和DNase I在37°C温和搅拌，在混合器上以24 rpm的速度温和搅拌30分钟（步骤2-16）。该步骤可将EV从其所包裹的组织中分离出来。采用孔径为0.70 µm的过滤器进行过滤，以除去大的组织块、颗粒等（步骤17-24）。剩余的液体分别在300g和2000g离心20分钟，以去除细胞和组织碎片（步骤25-28）。然后将上清液进一步以16,500g离心20分钟以收集大型EV（lEV）的粗馏分，并以118,000g离心2.5 h以收集小型EV（sEV）的粗馏分（步骤29-38）。两种类型的EV可以用于下游分析，也可以进一步处理以分离EV的亚群。为了进行进一步处理，将lEV和sEV加载到各个碘克沙醇密度梯度（OptiPrep）上。粗制EV溶解在60％（wt / vol）的OptiPrep中，并在顶部放置不连续的碘克沙醇梯度（35％，30％，28％，24％，22％×2和20％（wt / vol）的OptiPrep）（步骤39A（i-vii））。以186,000g离心16小时后，总共收集了四个亚群EV（步骤39A（viii-xiv））。从20–22％（wt/vol）的碘克沙醇（~1.111–1.121g/cm3）界面可收集两个EV亚群——大的低密度（LD）EV和小的低密度（LD）EV，从30–35％（wt/vol）碘克沙醇层（~1.163–1.189g/cm3）的界面可收集另外两个EV亚群——大的高密度（HD）EV和小的高密度（HD）EV。

图3. EV的鉴定
可以使用多种方法来进行EV表征，以评估EV大小、浓度、分子特性和货物。该文演示如何从人类转移性黑色素瘤中分离出EV，并通过TEM（步骤40A）、RNA谱分析（步骤40B）。此外，还描述了如何进行蛋白质组学分析（步骤40D）和蛋白质印迹（步骤40E）。为了减少执行整个组织EV分离方案所需的时间，可以应用另一种较短的方案，包括碘克沙醇密度垫作为不连续密度梯度的替代品（图4）。该替代方案仍然产生与可溶性蛋白质分离的高纯度EV，但是lEVs and sEVs被装载在相同的密度垫上，因此作为混合物被分离。简而言之，将lEV和sEV的粗馏分混合在一起，并重悬于60％（wt / vol）的OptiPrep中（步骤39B（i-ii））。在样品的顶部放置两层30％和10％（wt / vol）OptiPrep（步骤39B（iii-v））。在186,000g离心2.5小时后，从10％和30％（wt / vol）碘克沙醇层的界面收集EV（步骤39B（xi）），并用TEM表征（步骤40A）（图4）。在10％和30％（wt / vol）碘克沙醇之间的界面处发现了lEV（图4，黄色箭头）和sEV（图4，蓝色箭头），而仅可见少量囊泡在30％至60％（wt / vol）碘克沙醇界面处的非囊泡成分中。
图4. 碘克沙醇垫层分离（步骤40B）

图5. 组织EV分离程序的分步可视化
具体步骤如下，
样品收集、解离和消化：

差速离心：

EV亚群的分离

（详细protocol可至论坛下载PDF文件）
参考文献：CrescitelliR, Lässer C, Lötvall J. Isolation and characterization of extracellularvesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols.2021 Jan 25. PMID: 33495626.

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