外泌体浓度非常非常低

husthuagai

我提取了几次外泌体，使用超速离心的方法。每次测的浓度都是特别低。具体如下：肿瘤细胞200ml培养48h的上清（去除外泌体的10%培养基），2000g 10min去除死细胞，使用超滤管浓缩到25ml，18，000g 20min去除细胞碎片，然后两次12万g 70min，最后离心后，我还是能看到明显的沉淀的，然后我用1ml PBS重悬，最后用0.22um滤器过滤。
这是我的简要步骤。
我在使用0.22滤器前和滤器后测浓度，bca法，分别是0.08ug/ul、0.05ug/ul。这也太低了！！！但是我明明看到沉淀了。这个我已经重复三次了。每次都差不多！
我真的好头痛，这到底是为什么？
求求哪位大神救救我，我真的找不到原因了！
先谢谢！！！

芮苏遥

1.沉淀量？拍个照更好参考
2.细胞量多少？或者说培养瓶或皿的细胞密度？
3.细胞类型会影响外泌体产量

蓝泪陨星

是不是BCA测不出来？我用试剂盒提取的外泌体，用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法

husthuagai

芮苏遥 发表于 2018-1-5 16:51
1.沉淀量？拍个照更好参考
2.细胞量多少？或者说培养瓶或皿的细胞密度？
3.细胞类型会影响外泌体产量 ...

1.下次做的时候拍照上传给您看下
2，用的15cm的培养皿，都是长到70%左右换成去外泌体的培养基，然后48h，一般收上清时候>90%的密度
3. 膀胱肿瘤细胞系，我也是尝试了另一个细胞系，含量更加低。同时做电镜，现在的细胞系还能找到几个外泌体在一起的图片，另一个细胞系只能找到单个的外泌体图片，而且很少

husthuagai

蓝泪陨星 发表于 2018-1-5 16:57
是不是BCA测不出来？我用试剂盒提取的外泌体，用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法 ...

测不出来不可能吧，浓度很低，不要把你的外泌体稀释20倍，稀释10倍或者不稀释试试

蓝泪陨星

husthuagai 发表于 2018-1-5 17:09
测不出来不可能吧，浓度很低，不要把你的外泌体稀释20倍，稀释10倍或者不稀释试试 ...

我说的“测不出来”指的是浓度很低（表达有误），和你差不多

阿君

裂解了吗 测之前？

三莫

同认为1ml太多了，试试100ul

芮苏遥

husthuagai 发表于 2018-1-5 17:03
1.下次做的时候拍照上传给您看下
2，用的15cm的培养皿，都是长到70%左右换成去外泌体的培养基，然后48h， ...

细胞状态可以的话，尝试增加开始收集上清细胞密度（90%左右）和收集时间（我有试过最长96h的）。
15cm dish 我加12ml上清，试过life 试剂盒和超离，200ml上清超离所得沉淀我大概用了200ul重悬
还有微膜过滤步骤是必须的吗，会不会过滤损失掉？还有不清楚过滤会不会影响外泌体结构稳定

SYSUCC-Deng

芮苏遥 发表于 2018-1-7 00:30
细胞状态可以的话，尝试增加开始收集上清细胞密度（90%左右）和收集时间（我有试过最长96h的）。
15cm di ...

15cmdish才加12ml培养基吗？太少了吧。