miRNA引物自己设计靠谱吗？

kadak007

请教下各位，从exo中提取miRNA，逆转为cDNA， 再行PCR，我所用的试剂盒不提供miRNA的上游引物，
你们是从公司直接订购miRNA引物，还是自己设计好让公司合成呢？
网上有很多miRNA引物设计的信息，看起来挺简单，不知道可靠性怎样......
给点建议把，谢谢~

kadak007

Johnny 发表于 2015-9-2 22:12
靠谱！我们实验室做miRNA的都是自己设计引物的

版主，麻烦看下这个设计方法靠谱吗？ 可行的话我就按这个办

以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU。
每个正向引物带有一段固定的序列，固定的序列为：GGG
在这个序列后加上于成熟体 除后面6个外 剩下的碱基序列，成熟体除掉后面6个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：5，-GGG GTCCAGTTTTCCCAGGA -3，

kadak007

Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法，他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物， ...

很详细很给力，谢谢版主指导~

kadak007

Johnny 发表于 2015-9-5 18:46
不客气~~~~~~~~~~

版主，关于引物设计的后续规范再麻烦下：
我所用的miRNA荧光定量检测试剂盒已提供下游引物，估我只需提供上游引物序列，以hsa-mir-145为例，即提供5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3即可
1、公司要求提供 OD值 和 纯化方式。这个怎么写？有惯例吗？
2、我用的试剂盒提供的下游引物Tm值65℃，故建议上游引物Tm值为65℃左右。我用DNAstar检测引物，Tm值为72.7℃。那我只保留固定序列中的一部分（AGCTGGG ），使TM值为64.6℃。这样做可行吗？
麻烦指导下，谢谢~~

kadak007

Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系，能P出来就行

好的，多谢~

子非鱼

Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系，能P出来就行

版主，颈环引物设计好随便交给哪个公司都可以吗？还是说要送给特定的公司设计才能用啊？

烟尽云淡

Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法，他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物， ...

Johnny大神，想请教下，我看你们的经验“正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG”，想问下，你们这段固定的序列是自己摸索出来的哇？
而且，我一一看了你下面列举的你们设计的FP，发现好像前面并没有ACACTCCAGCTGGG这段固定序列呢？

afra

Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法，他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物， ...

大神，还麻烦问一下，逆转录用的kit?
另外，这个univeral reverse primer是什么用途?

谢谢大神！

wchl0918

多谢分享，受教受教

zhang4083

我怎么觉得版主给我讲糊涂了，版主能不能出来，再给普及一下知识呀，
对我这种小白来说，
你这反向引物，正向引物，还有Universal Reverse Primer引物，以及后面的Taq引物给我整糊涂了？

是不是第一个反向引物是逆转录引物。

而正向引物和universal reverse primer才是反向引物呀。