第一次超离心WB结果，求大神帮忙看一看

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-26 16:20:28

第一次用超离心分离exo，离心程序2000g 20min-10000g 30min-100000g 2h-100000g 2h，离心后沉淀很少，用80ulPBS重悬后，加入loading buffer，95度 5min煮，然后按6ul 8ul 10ul上样，用calnexin、TSG101、CD9杂条带，结果可以看到，cal仍然存在说明exo不纯，TSG101显出了条带，但CD9完全没有显出(CD9抗体之前有用别的蛋白验证过，没有问题)。想求问一下各位大神，超离心后的exo的WB是否可以做出干净的条带(无阴性marker)？或者是需要进一步纯化才行？另外，我之前试过小鼠血清提取的exo，CD9也很淡；这次用的是CHO细胞，完全没有CD9，是不是CD9在这些exo可能没有表达？谢谢！！

陆峰彬 · 发表于 2016-6-1 19:04:31

hzangs 发表于 2016-5-27 15:34
你不杂cell lysis
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了，而你不告诉这一堆水果总共有多少个 ...

请问版主你怎么保证外泌体和细胞上的蛋白量相同，BCA不是很精确，内参选什么？

hzangs · 发表于 2016-5-26 20:12:55

你这个怎么没有 cell lysis的对照…… 没有细胞对照不好讲啊……

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-27 15:19:46

hzangs 发表于 2016-5-26 20:12
你这个怎么没有 cell lysis的对照…… 没有细胞对照不好讲啊……

因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的exo的纯度吗？分离的exo的阴性marker要怎样才能除去呢？请前辈赐教。

hzangs · 发表于 2016-5-27 15:30:34

dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

这个我不太清楚。你最好还是要杂一下 cell lysis 这样才能大概反映出你的样品里不是exosomes的组分影响大概有多大。不然你这个没办法评判啊……

hzangs · 发表于 2016-5-27 15:34:33

dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

你不杂cell lysis
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了，而你不告诉这一堆水果总共有多少个。
如果只有10个果子，几个坏了那确实说明有问题。如果数千个果子只有几个坏了，那没事啊。

如果你杂cell lysis 和exosomes样品上同样的蛋白量。发现阴性marker在cell lysis里已经过曝了，而exosomes样品里只有一点点，那就说明你的污染不是很重，直接忽视就好。而如果两者接近，那就说明污染很严重，样品不能当做exosomes样品了。

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-27 15:34:43

恩，好的，我这次离心把cell也带上，谢谢前辈！

小孔加油 · 发表于 2016-6-22 20:35:30

请问您一次超离多少培养基得到的外泌体，才能保证做western的量？谢谢！

小孔加油 · 发表于 2016-6-22 20:37:21

请问您是80ul PBS重悬外泌体后，直接加loading 煮的，没有经过裂解液提取蛋白那一步吗？

dengsilong1991 · 发表于 2016-6-23 09:32:40

小孔加油发表于 2016-6-22 20:35
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体，才能保证做western的量？谢谢！

我也才超离过三次，前两次是60ml离心，80ul溶解，直接loading buffer煮后，10ul上样，能见条带

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