PEG聚沉+超速离心试用报告：Sci Rep文章技术重复

hzangs · 发表于 2016-6-5 20:21:16

wangjkm 发表于 2016-6-5 19:00
楼主，我想咨询一下，外泌体具体WB怎么跑？提取出来后用少量PBS重悬后，需要超声和BSA测浓度吗？还是直接加 ...

我收到外泌体后会直接使用BCA 定量，然后loading buffer 煮。没有额外的裂解步骤。

wangjkm · 发表于 2016-6-5 20:43:47

hzangs 发表于 2016-6-5 20:21
我收到外泌体后会直接使用BCA 定量，然后loading buffer 煮。没有额外的裂解步骤。 ...

20ul体系的话，基本上都上多少蛋白呢？

hzangs · 发表于 2016-6-5 20:46:59

wangjkm 发表于 2016-6-5 20:43
20ul体系的话，基本上都上多少蛋白呢？

这要看你起始的培液体积以及你的使用的细胞系是否是外泌体释放量比较高的细胞系。

gracexiguan · 发表于 2016-6-6 11:02:01

hzangs 发表于 2016-6-5 20:21
我收到外泌体后会直接使用BCA 定量，然后loading buffer 煮。没有额外的裂解步骤。 ...

您BCA测浓度能测到多少呢？

hzangs · 发表于 2016-6-6 11:03:52

gracexiguan 发表于 2016-6-6 11:02
您BCA测浓度能测到多少呢？

100ng/ul 左右的蛋白浓度

Mars · 发表于 2016-6-7 10:01:09

hzangs 发表于 2016-6-5 20:46
这要看你起始的培液体积以及你的使用的细胞系是否是外泌体释放量比较高的细胞系。 ...

楼主最近用了50ml上清提取外泌体PEG6000法，超离前隐约看到点，超离后完全看不到啊，这个怎么整

hzangs · 发表于 2016-6-7 10:06:11

Mars 发表于 2016-6-7 10:01
楼主最近用了50ml上清提取外泌体PEG6000法，超离前隐约看到点，超离后完全看不到啊，这个怎么整 ...

这个问题描述有点太模糊了……
但是你可以尝试在超离前取一部分样品跑个WB 看看有没有exosomes的marker，以判断是超离前的问题还是超离后的问题。

Mars · 发表于 2016-6-7 10:24:36

hzangs 发表于 2016-6-7 10:06
这个问题描述有点太模糊了……
但是你可以尝试在超离前取一部分样品跑个WB 看看有没有exosomes的mark ...

好的，就是我正常离心超离前有一个3000多g的离心1h,这个时候还能勉强看到，然后超离啥也看不多

hzangs · 发表于 2016-6-7 10:48:37

Mars 发表于 2016-6-7 10:24
好的，就是我正常离心超离前有一个3000多g的离心1h,这个时候还能勉强看到，然后超离啥也看不多 ...

如果有条件的话，你可以考虑直接10000g 去离心1个小时

菡姝 · 发表于 2016-6-15 13:40:37

你好，我想请教一下，重悬与PBS时，对PBS的体积有要求吗？

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