有点不是很理解

effiezhang66

@hzangs@Johnny，严重同意，相信文章里那么点CM就能见沉淀的，满满血泪史。求问大牛们，为了节省细胞，提高提取效率，我现在用完全超离提出的做TEM, 用SBI盒子提出的可以看到沉淀的加PBS120000g洗70min去掉杂蛋白,然后做蛋白组学，靠谱吗？

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 14:10
@hzangs@Johnny，严重同意，相信文章里那么点CM就能见沉淀的，满满血泪史。求问大牛们，为了节省细胞，提高 ...

TEM 应该没问题。  后面的蛋白组学分析，没有用这些方法尝试过，所以没办法评价。

effiezhang66

hzangs 发表于 2015-12-25 15:57
TEM 应该没问题。  后面的蛋白组学分析，没有用这些方法尝试过，所以没办法评价。 ...

谢谢！！！

effiezhang66

Johnny 发表于 2015-12-25 18:45
既然可以用完全超离得到exosome，为什么还要用试剂盒呢？

如果你像图个试剂盒的方便的话，你倒是可以反 ...

因为感觉盒子提出来的的确比超离提出来的多太多，所以考虑一方面盒子的提取效率是不是相对高一点但同时杂蛋白比例比较多，所以想通过提完后再溶解于PBS用超离尽可能洗掉杂蛋白。因为用的不是细胞系所以细胞比较珍贵才想到这种方法，想听听大牛意见~

effiezhang66

Izon 发表于 2015-12-25 19:15
既然知道沉淀类的试剂盒会带来大量的杂蛋白，还想用这样的分离方法提取的样品做蛋白组学？！，靠谱吗？"有 ...

您好，因为我的细胞量特别有限，我的理解是同样多细胞盒子的提取效率可能更高，所以想尽可能地洗掉盒子提取出EV里的杂蛋白，这样既节约细胞，又可以去除杂蛋白~

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 21:07
您好，因为我的细胞量特别有限，我的理解是同样多细胞盒子的提取效率可能更高，所以想尽可能地洗掉盒子提 ...

你的方法 复旦大学貌似有同学用过，并且去打了质谱。

考虑到你使用试剂盒沉淀  在用PBS洗一次，再超离， 应该是可以去掉一部分杂蛋白的。 但是个人建议，如果是后续实验去打质谱，  干脆点  什么kit都不要用， 就用超离 ， 起码反映的结果 是最靠谱的，也是最不容易被argue的。

effiezhang66

hzangs 发表于 2015-12-25 21:15
你的方法 复旦大学貌似有同学用过，并且去打了质谱。

考虑到你使用试剂盒沉淀  在用PBS洗一次，再超离，  ...

那现在大家难道只能用盒子提出的EV做形态学实验和鉴定吗？功能学的刺激或者蛋白分析是不是还是要超离呢？谢谢大牛

hzangs

effiezhang66 发表于 2015-12-25 21:20
那现在大家难道只能用盒子提出的EV做形态学实验和鉴定吗？功能学的刺激或者蛋白分析是不是还是要超离呢？ ...

大牛谈不上…… 还请不要这么称呼。

论坛里 也有朋友 使用kit分离exsome 去做功能和蛋白分析。 但是之前惜名的师兄用kit分离的exsome做实验，投paper的时候 被argue了， 但是后来他们用超离的方法去重复实验，结果基本和kit的结果是一致的， 目前也有朋友说实验去验证过 沉淀试剂盒沉淀中杂蛋白量并不大……   众说纷纭。
所以 安全起见，现在还是用超离最靠谱，超离也是目前主流的几个CNS和CNS子刊 paper 一直在用而且是唯一在用的方法。

effiezhang66

还想请教朋友，有没有好的办法可以提高超离的效率呢？因为用的不是细胞系，实在是太费细胞了，5555