讨论：血清外泌体提取后杂marker条带-背景高

wooway

我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝！我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后是否会再离心一次去除沉淀，之后再加LOADING buffer煮！然后你RIPA裂解液是什么品牌的，我一直用的我们平时裂解细胞的裂解液！

wooway

这是我考马斯亮蓝的图！！！！

子非鱼

wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝！我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

裂解之后没再离心了直接加loading了，你可以试试离心，我用的裂解液是实验室技术员配制的RIPA，具体成分品牌我现在不清楚.......还有你的考马斯在哪里？我么有看到

子非鱼

wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝！我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

补充一句：我用的和裂解细胞的一样，据说有童鞋没加裂解液也可以做出来，我之前设了这个对照，但因为上样量的原因，结果不好，但是应该是可行的，感觉裂解液有作用，但没辣么大，感觉“加不加裂解液”不是”有或无“的结果，wooway可以试试，祝成功~

wooway

子非鱼 发表于 2016-1-15 18:40
裂解之后没再离心了直接加loading了，你可以试试离心，我用的裂解液是实验室技术员配制的RIPA，具体成分 ...

图片传不上去不知道啥子个情况。。。

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

斑竹，昨晚刚出锅的条带，有空来看~

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

提取exosome后的血清，查网上帖子血清浓度太高，约有说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处由于稀释液准备不够，只进行了4倍的稀释（RIPA稀释），+5Xloading buffer，每个well上样6μl。

hzangs

子非鱼 发表于 2016-1-16 11:49
提取exosome后的血清，查网上帖子血清浓度太高，约有说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处 ...

谢谢~
这么看  确实有些marker蛋白可能在血清中游离。  不过exosome样品还是会富集的。  谢谢你的数据~~

hzangs

子非鱼 发表于 2016-1-16 11:49
提取exosome后的血清，查网上帖子血清浓度太高，约有说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处 ...

也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的？

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-16 11:53
也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的？

说实话，是不是一致我不确定，样品我都分出来一些，晚上统一测浓度看看~